第八章 现代生物学.ppt

第八章 现代生物学技术在蛋白质工程中的应用 传统技术：分离纯化技术，如层析技术、电泳技术；蛋白质鉴定技术，如免疫印迹 技术、酶联免疫吸附测定（ELISA） 新技术：对蛋白质进行分析鉴定的蛋白质芯片技术、蛋白指纹图谱技术；研究蛋白质相互作用的表面等离子体共振技术、酵母双杂交技术；用于功能蛋白质筛选的表面展示技术 第一节 蛋白质分析鉴定技术 一、蛋白质芯片技术 蛋白质芯片（protein chip）技术是为满足人们对蛋白质的高通量、大信息量、平行分析研究而产生的。蛋白质芯片的产生将基因组学平台和蛋白质组学平台很好地连接起来。 1 蛋白质芯片的概念 蛋白质芯片（protein chip）也叫蛋白质微阵列（protein microarray)，是将大量蛋白质有规则地固定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片（如图）。 2 蛋白质芯片的分类 根据用途的不同蛋白质芯片可分： 蛋白检测芯片 蛋白功能芯片 蛋白检测芯片：将具有高度亲和特异性的蛋白质或多肽，如单克隆抗体、小片段抗体、受体等固定在载体上，制备检测芯片用以识别复杂生物样品中的抗原、目标多肽和蛋白等。 蛋白功能芯片：将天然蛋白、酶或酶底物固定在载体上制成芯片，主要用于天然蛋白活性及分子亲和性的高通量分析，可用来进行蛋白-蛋白、蛋白-多肽、蛋白-小分子、蛋白-DNA-RNA结合以及蛋白-酶反应的研究。 3 蛋白质芯片的制备 Cavin M等制作出高密度蛋白质微阵列 4 蛋白质芯片中探针的标记 探针类型：蛋白质、酶或其它配基 标记物类型：荧光染料、酶，此外还有红色荧光蛋白（RFP）和绿色荧光蛋白（GFP） 5 蛋白质芯片信号的检测及数据处理 信号检测：激光共聚焦检测 、电荷藕合器件（CCD）检测 数据处理：应用一定的计算机软件对检测中的扫描图进行处理，形成数据，得出结论。 6蛋白质芯片的特点 快速、定量分析大量蛋白质； 使用简单，结果正确率较高，只需少量血样标本即可进行分析和检测； 采用光敏染料标记，灵敏度高，准确性好； 所需试剂少，可直接应用血清样本，便于诊断，实用性强，其不足在于稳定性及操作复杂等因素限制。 7蛋白质芯片的应用 （1）基础研究方面的应用 蛋白质—DNA相互作用研究:用生物化学表面芯片（PS20），以 DNA 作诱饵，结合特异蛋白质，用质谱法检测，筛查转录因子。 蛋白质-mRNA 相互作用研究:通过mRNA 转录与 RNA 结合蛋白质的内在联系建立了一种高通量的方法，用于鉴定在结构上和功能上有关的 mRNA 转录。 （2）临床方面的应用 蛋白质芯片技术在临床方面有着广泛的应用，尤其是在疾病的诊断和疗效判定，即生物学标志物的检测上，蛋白质芯片技术具有很大的应用价值和前景。如应用于自身性免疫疾病的诊断 ，肿瘤的早期诊断等。由于蛋白质芯片是在分子水平进行诊断和预测的，因而它提供了一种更准确的方法。 （3）新药研制方面的应用 研制一种新药往往要对上千种化合物进行筛选，低耗、快速、高效地筛选出新药或待选化合物是目前新药开发工作的重中之重。蛋白质芯片高通量、并行性的特点，大大地加快了化合物的筛选速度。 蛋白质芯片技术还对中药现代化有巨大作用。 利用蛋白质芯片跟踪药物所引起的蛋白质的表达就可以确定被检药物对人体是否有毒副作用，或达到多大剂量才会引起毒副作用。 （4）环境监测及食品工业中的应用 蛋白质芯片还能运用于环境监测及食品工业中，用来检测环境或食品中微量的有毒化学物质或病原菌，如大肠杆菌。 二、蛋白指纹图谱技术 蛋白指纹图谱技术也称为表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（surface enhanced laser desorption/Ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS），是一种包含层析与质谱的特殊蛋白质芯片技术，用于蛋白质的定量分析。它结合了芯片微阵列与质谱技术两者的优点，是继基因芯片之后出现的新一代生物芯片技术。 1 原理 2 组成 3 应用 结合生物信息学的分析方法从大量的蛋白质和多肽中筛选出潜在的生物标记物，建立高特异性和敏感性的蛋白质指纹图谱模型。 蛋白指纹图谱技术在医学领域的应用，主要用于多种疾病，特别是肿瘤的早期诊断。 第二节 研究蛋白相互作用技术 一、表面等离子体共振技术 1原理 SPR 生物传感器广泛的用于各类生物体系的测定，包括各类小分子化合物（分子量可小至100 Da）、多肽、蛋白质、寡核苷酸甚至脂分子、病毒和细胞。 SPR 生物传感器不需要借助任何标记即可用于分析蛋白质-蛋白质、蛋白质-小分子、蛋白质-核酸和蛋白质-脂的相互