膠质瘤论文转染缝隙连接蛋白CX在脑胶质瘤化疗旁观者效应影响的体内外实验研究.doc

胶质瘤论文：转染缝隙连接蛋白CX43在脑胶质瘤化疗旁观者效应影响的体内外实验研究 【中文摘要】通过构建并转染pCMV-Cx43cDNA质粒入C6细胞,上调缝隙连接蛋白CX43表达,增强缝隙连接功能。探讨转染缝隙连接蛋白CX43对脑胶质瘤化疗体内外旁观者效应影响。方法：1、通过C6细胞培养,并提取总RNA,行RT-PCR、质粒酶切及连接等,构建缝隙连接蛋白CX43真核表达重组质粒pCMV-Cx43cDNA,2、通过脂质体行重组质粒pCMV-Cx43cDNA转染C6细胞,过表达C6细胞缝隙连接蛋白CX43, RT-PCR及weston-blot检测CX43 mRNA及蛋白表达水平变化。划痕荷载染料传输实验法检测转染缝隙连接蛋白CX43后缝隙连接功能。3、通过体外TRASWELL细胞共培养模型,将转染pCMV-Cx43cDNA、空载体细胞分别分成化疗药物替膜唑胺处理组与替膜唑胺未处理组细胞,然后将两组细胞按一定比例分别接种TRASWELL细胞共培养板膜两侧,检测未化疗处理细胞存活率及凋亡率,观察体外转染CX43对体外化疗旁观者影响。4、建立体内脑胶质瘤化疗荷瘤鼠模型观察化疗旁观者效应：将转染pCMV-Cx43cDNA、空载体细胞分别分成化疗药物替膜唑胺处理组与替膜唑胺未处理组细胞,然后将两组细胞按一定比例进行混合,接种裸鼠皮下,观测各组成瘤时间及成瘤大小及体内脑胶质瘤化疗旁观者效应情况。结果：1、成功构建带CX43基因的真核表达pCMV-Cx43cDNA重组质粒2、成功转染C6细胞并筛选稳定转染过表达CX43细胞株(C6-Cx43)及转染空载体的细胞株(C6-non), C6-Cx43细胞Cx43mRNA及CX43蛋白表达显著增加3、在体外TRASWELL细胞共培养模型中,观察到体外未化疗细胞调亡的旁观者效应,(C6-Cx43)组与对照组存在明显统计学差异。4、在体内化疗荷瘤鼠模型中(C6-Cx43)组与对照组(C6-non)在成瘤时间及成瘤大小上存在明显的统计学差异。表现为在化疗药物替膜唑胺处理细胞占一定比例时,在(C6-Cx43)组与对照组(C6-non)比较,(C6-Cx43)组成瘤时间及成瘤大小明显抑制,且其差异明显大于化疗处理细胞占0%时(C6-Cx43)与(C6-non)成瘤大小的差异。结论：1、C6细胞转染重组质粒pCMV-Cx43cDNA,缝隙连接蛋白CX43表达增高,C6细胞GJIC功能增强。2、在体外化疗时,C6-Non、C6-Cx43都存在化疗旁观者效应,而C6-Cx43的化疗旁观者效应显著。即转染缝隙连接蛋白CX43能放大体外化疗的旁观者效应。3、在体内化疗时,转染缝隙连接蛋白CX43同样能放大化疗的旁观者效应。 【英文摘要】:To construct pCMV-Cx43cDNA plasmid transfected into C6 cells, increased expression of connexin CX43, enhanced gap junction function. Discussion Transfection of connexin CX43 bystander effect of gliomas chemotherapy in vivo or in vitro.Method:1. Connexin CX43 by constructing eukaryotic expression plasmid pCMV-Cx43cDNA, and transfected into C6 cells, C6 cells overexpressing connexin CX43, RT-PCR and weston-blot detection of CX43 mRNA and protein levels. Scratch loading dye transfer experiments applied to assay of gap junction protein CX43 gap junction after the function.2. TRASWELL cells in vitro co-culture model, transfection of pCMV-Cx43cDNA, empty vector cells were divided into chemotherapy treatment with Temozolomide Temozolomide untreated cells, and then two groups of cells at a certain percentage of cells were seeded TRASWELL across the me