第四讲：酶的分离与纯化.ppt

一、酶的浓缩 浓缩是从低浓度酶液中除去部分的水或其他溶剂而使之成为高浓度溶液的过程。 抽提液(或发酵液)中酶浓度一般都很低，所以在进行纯化前往往须先予以浓缩，通过浓缩可以提高浓度、缩小体积，同时酶和蛋白质在浓缩溶液中的稳定性也较高。 常用的浓缩方法： 蒸发、超滤、凝胶过滤、沉淀法、渗透 二、酶的结晶 结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。 酶在结晶之前必须经过纯化达到一定的纯度，通常酶的纯度应当在50％以上才能进行结晶。总的趋势是酶的纯度越高，越容易进行结晶。但是浓度过高时，会形成许多小晶核，结晶小，不易长大。有时为了进一步提高晶体的纯度，可以进行重结晶操作。 结晶方法： 盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法、等电点结晶法 三、酶的干燥 真空干燥 冷冻干燥 喷雾干燥 气流干燥 吸附干燥 6、酶制剂的类型 (1)液体酶制剂 (2)固体粗酶制剂 (3)纯酶制剂 (4)固定化酶制剂 作业? 名词解释： 盐溶、盐析、硫酸铵饱和度、亲和纯化技术 简答题： 1、简要说明酶的分离纯化一般程序。 2、简述酶分离纯化的基本原则。 3、简述酶分离纯化方法的分类及其原理。 ★酶的用途与纯度要求 用途 纯度 医疗用途、活体研究等 要求极高纯度(99％) x射线结晶、物理化学性质研究等 高纯度(95％～99％) N末端测序、生产抗原等 一般纯度(95％) ★酶蛋白性质及其对纯化策略的影响 样品性质 对纯化策略的影响 温度稳定性 迅速，且在低温下操作 pH值稳定性 选择合适的缓冲液，对离子交换、亲和色谱或反相色谱条件的选择 溶解稳定性 对反相色谱条件的选择 离子强度 对沉淀及疏水亲和色谱的条件的选择 蛋白酶敏感性 需去除蛋白酶或添加抑制剂 金属离子敏感性 在缓冲液中添加EDTA)或乙二醇双(2-氨基乙基)醚-四乙酸(EGTA) 氧化敏感性 需添加还原剂 分子量 对凝胶过滤介质的选择 类型 孔径 推动力 机制 微滤 0.02～10μm 0～1× 105Pa 筛分 超滤 0.001～0.02μm （相对分子质量103～105） 0～1× 105Pa 筛分 反渗透 无孔 （相对分子质量 1000） 0～1× 105Pa 溶液扩散 渗析 1～3nm 浓度差 筛分+扩散 电渗析 相对分子质量 200 电位差 离子迁移 渗透蒸发 无孔 分压差 溶液扩散 气体分离 无孔 0～1× 105Pa 溶液扩散 ★细胞结构与酶分布 ①双水相萃取 原理： 利用酶和杂蛋白等在不混溶的两个水相系统中分配系数的不同而达到分离目。 优点： ①萃取过程条件温和（两相中含有70％以上的水），酶活力损失较少，处理量可大可小； ②设备简单，仅需一个储罐和一个离心力不高的普通离心机； ③操作方便、快捷，回收率一般可达80％～90％。 ★各种双水相系统 聚合物P 聚合物Q或盐 聚丙二醇 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚糖 聚乙二醇 聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖 甲基纤维素 羟甲基葡聚糖，葡聚糖 乙基羟乙基纤维素 葡聚糖 羟丙基葡聚糖 葡聚糖 聚蔗糖 葡聚糖 聚乙二醇 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒石酸钾钠 利用PEGl500／NaH2PO4体系三步双水相萃取法 回收率达96.3％，纯化倍数为33 ②超临界流体萃取 原理： 将超临界流体作为萃取溶剂，利用分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同分离。 超临界流体：指物质状态超过临界点后的流体。 物理特性和传质特性通常介于液体和气体之间，黏度大大低于液体的黏度，接近气体的黏度，有利于物质扩散； 扩散系数接近于气体，是通常液体的近百倍，可迅速渗透到物体的内部而溶解目标物质，快速达到萃取平衡。 常见超临界流体的超临界点和超临界密度 流体名称 临界温度(℃) 临界压力 (Mpa) 临界密度 （g/ml） 乙烷C2H6 32.3 4.88 0.203 丙烷C3H8 96.9 4.26 0.220 丁烷C4H10 152.0 3.80 0.228 戊烷C5H12 296.7 3.28 0.232 乙烯C2H4 9.9 5.12 0.227 氨NH3 132.4 11.28 0.236 二氧化碳 CO2 31.1 7.38 0.46 二氧化硫 SO2 157.6 7.88 0.525 水H2O 374.3 22.11 0.326 笑气N2O 36.5 7.17 0.451 氟里昂C 28.8 3.90 0.578 ★最常用超临界流体为CO2 临界点的温度为31.1℃，接近常温 临界压力较低，为7.38MPa 无毒、操作较安全，且液体二氧化碳的扩散系数大，可获得高的传递速率 溶剂容易从产品中分离出来 ③反胶团萃取 反胶团是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水基