分子生物学实验教案,大纲,目录.doc

分子生物学实验室 实验目录 实验1 质粒DNA的提取、酶切与电泳 实验2 大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化 实验3 聚合酶链式反应扩增DNA片段 实验4 植物基因组DNA提取及电泳 实验5 植物RNA提取及电泳 实验6 RT-PCR技术 实验7 外源基因在原核细胞中的表达及分析 实验8 DNA重组体的构建与筛选 《分子生物学实验》教学大纲 英文名称： Molecular Biology Experiments 学分：1 学时：32 教学对象：生物工程专业、生物科学专业、生物技术专业 教学目的：在开设的理论课程的基础上，结合实验课程的教学，使学生能较全面系统的掌握分子生物学的基本操作，拓宽专业知识面，加深对专业知识的理解，强化动手能力。 基本要求：了解分子生物学的实验操作原理，掌握有关实验仪器的使用方法。 实验内容： 实验1. 质粒DNA的提取、酶切与电泳（8 学时） 基本要求: 通过学习碱变性抽提法对大肠杆菌中的质粒的抽提，掌握质粒DNA 的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA 的原理。进一步了解限制性内切酶的特性及酶切反应过程，掌握DNA 的酶切技术。 重点: 掌握质粒DNA 的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA 的原理。进一步了解限制性内切酶的特性，掌握DNA 的酶切技术。 难点: 掌握质粒DNA 的小量制备方法及DNA 的酶切技术。 实验2. 大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化（4 学时） 基本要求: 了解细菌基因组DNA 的提取的目的，原理，掌握细菌基因组DNA 的提取的实 验步骤及操作方法 重点: 掌握细菌基因组DNA 的提取的实验步骤及操作方法 难点: 掌握细菌基因组DNA 的提取的实验步骤及操作方法 实验3. 聚合酶链式反应扩增DNA片段（4 学时） 基本要求: 了解大肠杆菌感受态细胞的制备原理及转化反应的目的，应用范围及操作过程，掌握重组DNA 质粒转化大肠杆菌的操作技术。 重点: 掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的操作技术 难点: 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验4. 植物基因组DNA提取及电泳（8 学时） 基本要求: 熟悉聚合酶链反应（PCR）的基本原理、实验基本条件；了解 PCR 反应条件的优化和注意事项和应用范围 掌握聚合酶链反应（PCR）的实验技术：了解核酸琼脂糖凝胶电泳的原理及操作步骤，掌握琼脂糖凝胶电泳的实验方法。 重点: 掌握掌握琼脂糖凝胶电泳的实验方法。 难点: 聚合酶链反应（PCR）的实验技术，琼脂糖凝胶电泳的实验方法。 实验5. 植物RNA提取及电泳（4 学时） 基本要求: 学习从植物组织中提取总RNA的方法， 了解RT-PCR的基本原理和实验方法。 重点: 掌握从植物组织中提取总RNA的方法， 了解RT-PCR的基本原理和实验方法的基本步骤及实验结果的判定 难点: 凝胶电泳的实验步骤及实验结果的判定 实验6 RT-PCR技术 基本要求： 1、学习基因特异性引物的设计。 2、学习和掌握RT-PCR的原理和方法。 3、学习和掌握用半定量RT-PCR对基因表达水平进行相对定量的原理和方法。 重点：如何选择需要检测的目的基因 难点： 1 目的基因特异性引物的设计。 2 基因表达差异的分析。 实验7 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用 基本要求： 1.了解外源基因在原核细胞中表达的基础理论。 2.掌握乳糖操纵子的调节机制和操作方法。 重点: 掌握外源基因在原核细胞中表达方法 难点: 乳糖操纵子的调节机制和操作方法 实验8 DNA重组体的构建与筛选目 基本要求： 重点： 已转化的感受态细胞涂板培养，观察 难点： 阳性克隆目的基因DNA分子的鉴定学习和掌握细菌转化与目的基因DNA分子增殖及其鉴定的原理和方法。 实验1大肠杆菌感受态细胞的制备与DNA质粒转化 实验目的 掌握重组DNA 质粒转化至大肠杆菌宿主的操作技术。 实验原理 带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA,,该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。 大肠杆菌形态图 实验步骤 1 感受态细胞的制备： 1) 挑菌37℃培养。 2) 将过夜培养的细菌转接培养2-3 小时。 3) 将菌液置冰上10 分钟，4℃离心8000rpm 30 秒。 4) 用氯化钙溶液悬浮菌体，冰浴，离心弃去上清。 5) 氯化钙溶液悬浮菌体。 2 转化： 1) 取出感受态细胞,试剂A，无菌双蒸水和待转化的质粒DNA，均置冰盒内。 2) 取离心管管一支，将质粒、试剂A、无菌水，感受态细胞混匀冰浴20 分钟。 3) 在管内加入400u