一般微生物限度方法学验证..doc

微生物限度检查方法学验证 1、供试品：XXXXX胶囊（批号：XXXXXX） 2、菌种： 菌落计数用菌种： 枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501] 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003] 大肠埃希菌[CMCC（B）44102] 白色念珠菌[CMCC (F) 98001] 控制菌检查用菌种： 大肠埃希菌[CMCC（B）44102] 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003] 3、培养基：营养肉汤培养基、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷培养基（MUG）。 4、预试验 按照中国药典2005年版微生物限度检查法中常规法及培养基稀释法检验，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率均小于70%，本品有抑菌作用。 5、细菌、霉菌及酵母菌计数 按照中国药典2005年版微生物限度检查法进行细菌、霉菌及酵母菌计数的方法学验证试验及菌落计数。 5.1菌液制备： (1) 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤中，35～37℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml。 (2) 接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml。 5.2 供试液的制备 取供试品10g，pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，使呈1：10的供试品储备液。取1：10的供试品储备液 10ml，500转/分离心5分钟，取出上清液，pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至10ml，即为供试液。 5.3验证方法： (1) 菌液组 分别取菌液1ml，采用平皿计数法，测定上述制备好的菌液中每毫升的活菌数，测定结果见表1。 (2) 供试品对照组 取供试液1ml，采用薄膜过滤法，测定供试品本底的菌数，冲洗液为pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，每次100ml，冲洗三次，测定结果见表2。 (3) 试验组 取供试液1ml，按供试品对照组同法操作，在第三次冲洗液中加入50～100cfu试验菌，置规定温度培养2～5天观察结果，测定结果见表3。 (4) 稀释剂对照组 分别取500～1000cfu试验菌，按供试液的制备同法操作后，制备稀释剂对照液，测定菌数，测定结果见表4。 5.4测定结果 表1、菌液组菌落计数（cfu） 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 大肠埃希菌 1 2 平均 表2、供试品对照组菌落计数（cfu） 试验次数 细菌数 霉菌、酵母菌数 1 2 平均 1 2 平均 1 2 3 表3、试验组菌落计数（cfu） 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 大肠埃希菌 1 2 3 表4、稀释剂对照组菌落计数（cfu） 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 大肠埃希菌 1 2 3 表5、试验组回收率测定结果 回收率% 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 大肠埃希菌 1 2 3 表6、稀释剂对照组回收率测定结果 回收率% 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 大肠埃希菌 1 2 3 经上述实验验证，本品有抑菌作用，因此，采用离心和薄膜过滤法联用即可进行本品的微生物限度检查。 6、控制菌检查 按照中国药典2005年版微生物限度检查法进行控制菌的方法学验证试验及检查。 6.1菌液制备： 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤中，35～37℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使细菌数约为10～100cfu/ml。 6.2供试液的制备 同5.2项下供试品储备液的制备。 6.3验证方法 （1）试验组 大肠埃希菌 分别取供试液10ml，加入胆盐乳糖培养基100ml中，重复2份，其中1份加入大肠埃希菌10～100个作阳性对照，另取与供试液等量的稀释剂加入胆盐乳糖培养基100ml中作阴性对照，35～37℃培养18～24小时，取上述增菌液0.2ml，加入含5ml的4-甲基伞形酮葡糖苷培养基（MUG）试管中，置35～37℃培养5～24小时，观察结果，见表7。 （2）阴性菌对照组 验证大肠埃希菌 采用革兰氏阳性球菌金黄色葡萄球菌，取胆盐乳糖培养基100ml