微生物限度方法学验证.ppt

细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证回收率测定举例试液需用特殊制备方法（薄膜过滤法）菌液组：1ml菌液/平皿，每株菌平行2个平皿（计算平均菌数：C)供试品对照组：含1g或1ml的供试液，过滤冲洗，至少1张膜（菌落计数：B)试验组：含1g或1ml的供试液，过滤冲洗，+1ml菌液，过滤，至少1张膜（菌落计数：A)稀释剂对照组：稀释剂+菌液，过滤冲洗，至少1张膜（菌落计数：D)第32页,共56页，2024年2月25日，星期天细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证过滤细菌的膜贴在预先倒好并预培养过的营养琼脂培养基平板上，菌面朝上。过滤霉菌酵母菌的膜贴在预先倒好并预培养过的玫瑰红钠琼脂培养基平平板上，菌面朝上。试验组回收率=(A－B)÷C×%稀释基对照组回收率=D÷C×%第33页,共56页，2024年2月25日，星期天细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证计数方法的确定细菌计数方法与霉菌和酵母菌计数方法可以不一致。细菌以各试验菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）的回收率均能达到70%以上的检测方法为准。霉菌和酵母菌以各试验菌（白色念珠菌、黑曲霉）的回收率均能达到70%以上的检测方法为准。第34页,共56页，2024年2月25日，星期天细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证计数方法的验证——结果判断在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应均不低于70%。若试验组的菌回收率均不低于70%，则按此供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数能保证检验结果的准确、可靠。若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。第35页,共56页，2024年2月25日，星期天控制菌检查法的验证试验菌株：按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。阴性对照菌株:选择原则，口服选用金黄色葡萄球菌，外用选用大肠埃希菌。菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。加菌量:10～100cfu第36页,共56页，2024年2月25日，星期天控制菌检查法的验证验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。试验组：取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查.阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性，方法同试验组。第37页,共56页，2024年2月25日，星期天控制菌检查法的验证控制菌检查验证用菌株：大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌。第38页,共56页，2024年2月25日，星期天控制菌检查法的验证?口服制剂验证用菌株：大肠埃希菌大肠菌群沙门菌阴性对照菌菌株：金黄色葡萄球菌检查方法：大肠埃希菌按大肠埃希菌项下检查大肠菌群按大肠菌群项下检查沙门菌按沙门菌项下检查第39页,共56页，2024年2月25日，星期天控制菌检查法的验证外用制剂验证用菌株：铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌生孢梭菌阴性对照菌菌株：大肠埃希菌检查方法：铜绿假单胞菌按铜绿假单胞菌项下检查金黄色葡萄球菌按金黄色葡萄球菌项下检查生孢梭菌按生孢梭菌项下检查第40页,共56页，2024年2月25日，星期天控制菌检查法的验证验证方法选择：常规法、稀释法、薄膜过滤法、中和法、离心沉淀法、联合方法。供试品量：1g或1ml，沙门菌检查为10g。培养基：营养肉汤培养基、胆盐乳糖增菌液、MUG培养基、胆盐乳糖发酵管、四硫磺酸盐增菌液、胆盐硫乳琼脂平板、麦康凯琼脂平板、溴代十六烷三甲胺平板、甘露醇氯化钠平板、0.1%疱肉培养基、含庆大霉素的哥伦比亚琼脂平板。第41页,共56页，2024年2月25日，星期天控制菌检查法的验证菌液制备接种大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，35～37℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使菌数约为10～100cfu/ml。第42页,共56页，2024年2月25日，星期天控制菌检查法的验证常规法：大肠埃希菌：取相当于1g或1ml供试品的供试液