亲和层析的应用课件.ppt

亲和层析的应用 亲和层析 亲和层析（affinity chromatography）是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。 亲和层析法具有多方面的应用。 核酸的纯化 因为DNA与RNA之间具有专一性的亲和力，所以亲和层析可应用于核酸的研究，例如从大肠杆菌的RNA混合物中分离出专一于噬菌体T4 的RNA，可将T4的DNA以共价键结方式接于cellulose材质的管柱中，再将所要的RNA分离出。 此外，根据核酸与蛋白质之间交互作用的原理，可以将单股DNA接在Sepharose上，纯化DNA聚合酶或RNA聚合酶。 激素受体的纯化 激素受体是细胞膜上与特定激素结合的成份，激素和受体的作用具有特异性，目前用亲和层析法已经能够将激素与sephrose的组合，纯化胰岛素、正甲状腺素的受体。 抗体与抗原的纯化 抗体与抗原结合具有高度专一性，Sepharose是这一类亲和层析较佳的载体，由于抗原-抗体复合物的解离常数很低，因此抗原在固定化抗体上被吸附后，要尽快将它洗出，冲洗液的条件通常是控制pH值至3以下，成份为醋酸、盐酸、Tris-HCl缓冲液、20% 甲酸或1mol/L 丙酸，也有使用尿素这一类的蛋白质变性剂作为洗出用的溶液。 酶和酶的抑制剂纯化 使用亲和层析法纯化酶，可以得到相当好的效果。例如，要分离猪和牛的胰蛋白酶，可以连接鸡卵黏蛋白（胰蛋白酶的抑制剂）与Sepharose 4B当作层析柱材质，用它纯化出来的胰蛋白酶相当于5次再结晶的纯度。 除了使用抑制剂当配体，也可以反过来用酶作为配体来纯化抑制剂，例如，将胰蛋白酶接到Sepharose上，能有效分离纯化大肠杆菌中的胰蛋白抑制剂Ecotin。 Chitin 几丁质 CHOM 鸡蛋粘多糖蛋白 Trypsin 胰岛素 亲和层析的应用 亲和层析法分离胆固醇氧化酶 季文明,陈毅力等 江南大学生物工程学院 亲和层析法分离胆固醇氧化酶 胆固醇氧化酶是一种多功能酶。目前,医院应用胆固醇氧化酶检测血清胆固醇含量。胆固醇氧化酶可以降低食品中的胆固醇含量；能有效抑制鳞翅目昆虫的生长繁殖,是一种生物杀虫剂；胆固醇的氧化产物胆甾-4-烯-3-酮还具有抗肥胖、治疗肝病等药效。 亲和层析法分离胆固醇氧化酶 发酵产物经过盐析操作以后，得到层析用样品。 他们利用一种脂溶性凝胶SepherdexLH20作为胆固醇的载体,其分离的分子量小于3000。胆固醇也为脂溶性的化合物,与凝胶LH20有很好的相容性,而酶蛋白不能进入凝胶。 亲和层析法分离胆固醇氧化酶 他们每次进行实验时加入1~5ml的样品,用1~5倍体积的缓冲液A洗去杂物,流速为0.5~2ml/min；然后再用缓冲液B洗脱酶蛋白,流速为015~2ml/min。 亲和层析法分离胆固醇氧化酶 他们对表面活性剂的浓度和洗脱速度的条件进行了考察，得到用亲和层析分离纯化胆固醇氧化酶,酶比活从0.45U/mg提高到15.5U/mg。亲和层析的适合条件为洗脱液A的流速是015ml/min,洗脱液B的流速是210ml/min。 实验室内可用此法分离纯化胆固醇氧化酶,但是从实际操作和经济角度考虑，该法不适合大规模处理。 谢谢大家！ * 說明文字 * 說明文字