SN_T 2669-2010三系杂交水稻种子真伪分子鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2669-—2010三系杂交水稻种子真伪分子鉴定方法Molecular identification of three-line hybrid rice seeds2010-11-01 发布2011-05-01 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行~业标准三系杂交水稻种子真伪分子鉴定方法SN/T 2669--2010?中国标推出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 www. spc. net. cn.电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷广印刷*开本 880×12301/16　印张0.5字数,8.千字2011年3月第一版　2011年*3·月第一次印刷印数 11 600书号：155066·2-21677：定价：14.00元 SN/T 2669—2010前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国湖南出人境检验检疫局、国家杂交水稻工程技术研究中心。本标准主要起草人：赵文军、陈红运、朱金国、黄新、程毅、杨和华、朱水芳。 SN/T 2669—2010三系杂交水稻种子真伪分子鉴定方法范围,本标准规定了三系杂交水稻种子真伪分子鉴定方法本标准适用于通过胞质不育获得的杂交水稻种子的真伪鉴定规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T 1193基因检验实验室技术要求3.术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1三系杂交水稻　three-line hybrid rice包括不育系、保持系和恢复系用不育系作母本与其同型保持系杂交繁育不育系种子，用不育系作母本与恢复系杂交生产杂交稻种子4　原理根据水稻基因组中与雄性不育相关的线粒体R2-630WA基因片段的核苷酸序列,设计特异性引物和荧光探针，应用实时荧光PCR技术对杂交水稻种子进行快速鉴定，通过检测杂交水稻种子中是否含有胞质不育基因片段来判断真伪.。5．实验方法5.1主要仪器5.1.1实时荧光PCR仪。5.1.2核酸蛋白分析仪。5.1.3高速冷冻离心机，台式小型离心机,Mini 个人离心机。5.1.4 低温冰箱,冷藏冷冻冰箱。5.1.5 旋涡振荡器。5.1.6 微量移液器(2.5 μL、10.μL、20 μL、100 μL、200 μL、i 000 μL)。5.1.7 光化学PCR反应管。 SN/T 2669—20105.2主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。5.2.1．实验用水：应符合GB/T 6682中级水的规格.。5.2.2 -DNA 提取液:100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),20 mmol/L EDTA(pH8.0),500 mmol/L-氯化钠,质量浓度为1.5%的SDS。1:05kg/cm²高压蒸汽灭菌15min，4℃贮存，用前预热至60℃,使絮状沉淀完全溶解。5.2.3三氯甲烷十异戊醇十乙醇混合液：三氯甲烷+异戊醇＋乙醇=80十4165.2.4:10XPCR缓冲液。95.2.5氯化镁。5.2.6 dNTPs(含 dUTP):5. 2.7 UNG 酶(Uracil N-glycosylase)。5.2.8 Taq DNA 聚合酶。5.2.9引物和探针序列见表1实时荧光,PCR所用引物和探针序列表检测基因引物序列探针序列5-ggcggagagggattcattagt-3R2-630WAgggtactggtaccgcttaagccc-3*5-ggttagtgttggtga-3tcga5.3·实验步骤5.3.1样品制备受检样品的扦样、分样和保存按（TB543.2的规定随机抽取至少 20 粒种子进行检测。5.3.2样品DNA.的提取,取单粒种子,剥去颖壳和种皮碾压破碎后移至2.0I.离心管中；加入液氮，用玻棒充分研磨至粉末状;向离心管中加人 600 μL:DNA 提取液,60℃水浴 i4r,每隔 15 min 颠倒混匀一次;加人等体积的三氯甲烷十异戊醇+乙醇混合液，轻缓混匀，室温静置1h;12000g，4℃，离心15min，将上清液转移至另十支1.5,mL离心管中，加等体积异丙醇混匀，室温静置30min;12000g，4℃，离心15min，弃上清液;加200μL70%乙醇洗涤沉淀；12000g，4℃，离心.10min后弃去乙醇；重复洗涤一次后自然干燥DNA,