DNA序列定.ppt

DNA序列测定;第一节 概 述;二、DNA序列测定工作原理;三、核酸序列分析的目的意义和策略（具体方法）;四、测序的常用方法; 不管是上述哪一种方法，测序基本过程如下： 1、制备待测DNA序列模板； 2、酶促或化学反应将其转变“等差数列”（n=1）； 3、PAGE； 4、读序。（P255,图10-2）;六、测序技术的最近发展;七、DNA序列测定的应用;第二节 Sanger双脱氧末端终止法;（三） Sanger双脱氧链终止法的原理;二、试 剂;（二）模板 纯单链DNA和经过热变性或碱变性的双链DNA都可以用作Sanger法测定的模板。模板的质量和所用的DNA聚合酶的种类是至关重要的。 通常采用M13噬菌体颗粒分离到的单链DNA模板效果最佳，用变性双链DNA作模板则难获此效果。小量制备质粒DNA常被寡核苷酸小分子，核糖核苷酸及DNA聚合酶抑制剂所污染，前两者可被用作随机引物，造成假象和强终止现象，使测序胶含糊不清。采用小量制备质粒DNA测定未知DNA克隆片段的序列，并不可取，如果用CsCl-溴化乙锭梯度离心结果纯化质粒DNA，测序结果会好得多，但又耗费大量的人力和物力。;DNA序列测定模板制备方法 因为DNA是相当大的分子，一般由几kb组成，最小的质粒和病毒也在1kb以上，而测序的最好方法，一次也只能测几百个bp（以300-500bp为好，300bp最佳），所以测序前，可以用2种限制酶消化待测DNA，使其降解成小片段，用琼脂糖凝胶电泳分离回收。回收片段，如果超过700-800bp，则进行第二次限制酶消化，再次分离回收。然后分别测定每个片段的顺序。由于两种限制酶在DNA链上的切点位置不同，产生的片段之间有交错重叠顺序，据2片段的这种末端重叠现象，用计算机定出各片段的位置，而排出DNA的全部序列。 在测序中，小片段DNA只需直接克隆到M13mp或者质粒载体中，进行双链或单链模板测序。现在常用的M13mp载体一般是成对设计，如M13mp18与M13mp19都有相同的多克隆位点，但方向相反。同一待测的DNA片段分别克隆到这两个载体中，用一通用引物进行测序。对于数kb大片段DNA分子，则有几种策略，如定向克隆，内部片段克隆，原位亚克隆，包含上述用2种限制酶消化DNA等。;1、用噬菌体M13克隆待测DNA片段 1）噬菌体是寄生在细菌的病毒。存在3种状态，有尾20面体，无尾20面体和丝状单链噬菌体（filamentous），M13是一类雄性特异的大肠杆菌噬菌体，含单链环状的DNA。它感染细菌（宿主菌）呈溶原状态生长，在菌体内形成过渡阶段双链环状复制型DNA（Replicative form DNA，RF DNA），在适当的条件下，可以扩增至数百个拷贝。成熟的噬菌体成为单链（正链、RF则以正链为模板复制1条链，再以此链复制正链）分泌到培养液中。因此双链DNA（RF）可以按质粒提取方法从细菌细胞中制备，做为克隆所用的载体。从培养上清液提取成熟的单链DNA做为测序模板。 在感染过程中，M13并不杀死细胞，但细胞的生长受到某种程度抑制。dsDNA复制又产生大量的ssDNA，它被1个外壳蛋白包装成成熟的噬菌体，在细胞生长的过程中，子代噬菌体颗粒释放出来，这是M13不同于其他噬菌体的特点。每ml培养液沉淀的噬菌体可提取5-10mgssDNA，产量是很高的。用作克隆载体，M13有1个得天独厚的优点，即可产生大量含有外源DNA其中1条链的DNA分子，后者可在下列工作中充作模板： （1）末端终止法测序 （2）制备“放标”单链用于杂交DNA探针 （3）利用寡核苷酸进行定点诱变。;2）M13mp18和M13mp19载体 （1）mp系列载体特点： ①都是从同一重组M13mp1改造而来。 ②在基因II-IV（500bp，570bp左右）之间有1个多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）可供外源基因插入。 ③该区域（MCS）插入了1小段Ecoli.DNA，有β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列及其N端146个aa编码信息，它与宿主菌（含LacZ）α-互补，形成有活性的β-半乳糖苷酶，使平板上底X-gal生色成蓝噬菌斑，当外源基因插入MCS，破坏了α-互补，几乎无一例外生成无色（白）噬斑。这是一种非常有效的克隆筛选选择性标志。 （2）M13mp18和M13mp19是一对载体，它们有相同的13个多克隆位点，但方向相反。（当RF DNA被两种限制酶切割后，M13mp18和M13mp