【2017年整理】HPLC知识收藏.doc

高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法? ?诊状(一)保留时间变化可能的原因 : 解 决 方 法1.柱温变化 : 柱恒温 2.等度与梯度间未能充分平衡 : 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱 3.缓冲液容量不够 : 用25mmol/L的缓冲液 4.柱污染 : 每天冲洗柱 5.柱内条件变化 : 稳定进样条件,调节流动相 6.柱快达到寿命 : 采用保护柱(二)保留时间缩短可能的原因 : 解 决 方 法1.流速增加 : 检查泵,重新设定流速 2.样品超载 : 降低样品量 3.键合相流失 : 流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向 4.流动相组成变化 : 防止流动相蒸发或沉淀 5.温度增加 : 柱恒温(三)保留时间延长可能的原因 : 解 决 方 法1.流速下降 : 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡 2.硅胶柱上活性点变化 : 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱 3.键合相流失 : 同前(二)3 4.流动相组成变化 : 同前(二)4 5.温度降低 : 同前(二)5(四)出现肩峰或分叉可能的原因 : 解 决 方 法1.样品体积过大 : 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15% 2.样品溶剂过强 : 采用较弱的样品溶剂 3.柱塌陷或形成短路通道 : 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 4.柱内烧结不锈钢失效 : 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 5.进样器损坏 : 更换进样器转子(五)鬼峰可能的原因 : 解 决 方 法1.进样阀残余峰 : 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 2.样品中未知物 : 处理样品 3.柱未平衡 : 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱) 4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) : 每天新配,用抗氧化剂 5.水污染(反相) : 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水(六)基线噪声可能的原因 : 解 决 方 法1.气泡(尖锐峰) : 流动相脱气,加柱后背压 2.污染(随机噪声) : 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂 3.检测器灯连续噪声 : 更换氘灯 4.电干扰(偶然噪声) : 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等) 5.检测器中有气泡 : 流动相脱气,加柱后背压(七)峰拖尾可能的原因 : 解 决 方 法1.柱超载 : 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相 2.峰干扰 : 清洁样品,调整流动相 3.硅羟基作用 加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品 4.同前(四)4 : 同前(四)4 5.同前(四)3 5. : 同前(四)3 6.死体积或柱外体积过大 : 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管 7.柱效下降 : 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱(八)峰展宽可能的原因 : 解 决 方 法1.进样体积过大 : 同(四)1 2.在进样阀中造成峰扩展 : 进样前后排出气泡以降低扩散 3.数据系统采样速率太慢 : 设定速率应是每峰大于10点 4.检测器时间常数过大 : 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10% 5.流动相粘度过高 : 增加柱温,采用低粘度流动相 6.检测池体积过大 : 用小体积池,卸下热交换器 7.保留时间过长 : 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱 8.柱外体积过大 : 将连接管径和连接管长度降至最小 9.样品过载 : 进小浓度小体积样品液相色谱柱使用及保养液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。一、液相色谱柱的安装：? ?1、液相色谱柱的结构：? ?a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。? ?柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺纹，另一端是3／16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7／16英寸外螺纹与1／4英寸柱管(Φ6.35mm)连接，中间放置压坏用于密封。3／16英寸的内螺纹与1／16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接，中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2．5mm长或其他固定尺寸)。? ?在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留