SN 1247.1-2003猪繁殖和呼吸综合征间接免疫荧光试验.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1247.1—2003猪繁殖和呼吸综合征间接免疫荧光试验Protocol of indirect immunofluorescence assay forporcine reproductive and respiratory syndrome2003-05-28发布2003-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准猪繁殖和呼吸综合征间接免疫荧光试验SN/T 1247. 1—2003*中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×1230 1/16印张 1/22 字数 11 千字2003年10月第一版2003年10月第一次印刷印数 1—2 000+书号：155066·2-15329网址 www.bzcbs. com版权专有侵权必究举报电话：（010SN/T 1247.12003前 言本标准根据世界动物卫生组织(OIE)《哺乳动物、禽和蜜蜂 A 和 B类疾病诊断试验和疫苗标准手册》(第四版,2000)第三部分X.12的内容编写。本标准的附录 A、附录 B为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：孙延峰、孙颖杰、苏永生、简中友、潘凤城。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 SN/T 1247.1—2003猪繁殖和呼吸综合征间接免疫荧光试验范围1本标准规定了猪繁殖和呼吸综合征的间接免疫荧光试验诊断方法。本标准适用于猪繁殖和呼吸综合征的诊断、流行病学调查、检疫和疫情监测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682一1992分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本标准。3.1IFA间接免疫荧光试验。3.2 FITC异硫氰酸荧光黄。3.3PRRS猪繁殖和呼吸综合征。4检验检疫4.1原理接免疫荧光试验是将抗原吸附于固相载体上，抗原与抗体反应后，再用荧光素标记的抗抗体与其反应，形成抗原-抗体-抗抗体复合物，在荧光显微镜下可见荧光。本标准是以96孔板为载体，将接种猪繁殖和呼吸综舍征病的细胞固定于96孔板上，依次加入被检血清和用FITC标记的兔抗猪抗体，反应结束后，置荧光显微镜下观察结果。4.2采样采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜透明不溶血无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或一20℃～30℃冰箱保存或冷藏条件下立即送检。试验前将被检血清统一编号。4.3设备和材料4.3.1仪器设备-微量移液器；保湿盒；普通恒温箱及二氧化碳恒温箱；一普通冰箱和低温冰箱；一倒置显微镜；一荧光显微镜； SN/T 1247.1-—2003量简、烧杯等。4.3.2材料和试剂-MARC-145或HS,H细胞由国家质检总局认可的单位提供；PRRS美洲标准株ATCC VR-2332或欧洲标准株LV标准毒由国家质检总局认可的单位提供；PRRS病毒标准阳性血清和标准阴性血清由国家质检总局认可的单位提供；-FITC标记的兔抗猪抗体由国家质检总局认可的单位提供；-MEM营养液（含10%犊牛血清）；PBS液（见附录A)；EDTA-胰蛋白酶消化液（见附录 A);青霖素和链霉素，—犊牛血清;-96孔48 孔细胞培养板和细胞培养瓶4.4IFA诊断板的制备用 EDTA-胰蛋白酶消化液消化MARC-145或 HS,H细胞，用MEM营养液稀释成105细胞/mL，加人PRRS标准毒（美洲标准株ATCCVR-2332或欧洲标准株LV），使其最终浓度为100TCIDs/25μL(TCID。测定见附录 B)，加到96孔细胞培养板的1、3、5、7、9、11列各孔内，每孔100μL。在2、4、6、8.10、12列各孔内加人未感染病毒细胞悬液100μL。将该细胞培养板置37℃、5%二氧化碳培养箱中培养48h～72h，当细胞出现20%CPE时，弃去培养液，每孔加人一20℃的无水乙醇100μL(或80%的丙酮溶液100μL，4℃固定30min,弃掉丙酮溶液，置室温下风于）,置于一20℃或一70℃冰箱中备用。4.5IFA试验4.5.1取IFA诊断板并编号，（如果用无水乙醇固定，弃去板中的无水乙醇，置超净工作台中风干）每孔加100μLPBS液洗一次，弃去 PBS液并倒置在吸水纸上轻轻拍干。4.5.2在编号对应的孔内加人20倍稀释的被检血清：同一排相邻的感染细