雷公藤甲素诱导鼻咽癌细胞凋亡的作用及机制.docx

雷公藤甲素诱导鼻咽癌细胞凋亡的作用及机制 雷公藤素，又称雷公藤素和雷公藤烯醇，是卫矛科雷公藤属植物的一种环氧树脂二胺类药物。这是治疗风湿病科雷公藤片和雷公藤多酚片的主要有效成分。现代研究表明, 雷公藤甲素不仅具有高效的抗炎、抗类风湿作用, 还具有较强的抗肿瘤作用。研究发现, 其对某些肿瘤细胞的杀伤毒性甚至高于紫杉醇和阿霉素。但在鼻咽癌中的研究较少, 本文拟将雷公藤甲素作用于鼻咽癌CNE-2Z细胞株, 观察其抗鼻咽癌的作用, 并探讨作用的机制。 1 材料和方法 1.1 rpmi170培养基 雷公藤甲素 (天津美伦医药集团) ;CNE-2Z细胞株, 蚌埠医学院药学系生化药理实验中心提供;RPMI 1640培养基 (Gibco公司) ;兔抗人GRP78、Akt、p Akt抗体、鼠抗人β-actin抗体购自Santa Cruz公司;山羊抗鼠Ig G、山羊抗兔Ig G购自北京中杉金桥生物技术有限公司;ROS荧光探针-DHE (威格拉斯生物技术有限公司) 。 1.2 方法 1.2.1 mmol贮液 雷公藤甲素用二甲基亚砜 (DM-SO) 配成5.5 mmol·L-1贮液, -20℃保存。临用前以RPMI 1640培养基稀释成62.5、125、250、500、1000、2 000及4 000 nmol·L-1。 1.2.2 l-14ezea、nahco333.34.7.7.7.7.7.7l-13.7.7.7.7.7.7.77.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7.7日收学习惯法传代2. CNE-2Z细胞接种于含10%新生小牛血清、青霉素 (1×105U·L-1) 、链霉素 (100mg·L-1) 和Na HCO3(33.7 mg·L-1) 的RPMI 1640培养液中, 体积分数0.05 CO2、饱和湿度、37℃培养箱中培养, 每2~3天传代1次。 1.2.3 重组细胞存活率检测 细胞接种于96孔细胞培养板中, 5×103个每孔。培养24 h, 吸弃培养液, 加新鲜含10%血清培养液180μl, 对照组加入含0.01%DMSO的培养液20μl;药物处理组加入不同浓度的雷公藤甲素溶液各20μl, 使终浓度分别为6.25、12.5、25、50、100、200及400 nmol·L-1, 其中DMSO含量不超过0.01%;同时设立调零组 (无细胞组) , 加入200μl培养液。培养12、24、48 h后加入20μl MTT (以PBS配成5 g·L-1) , 37℃继续培养4 h, 弃上清, 每孔加入150μl DMSO, 37℃孵育30 min, 酶标仪上振荡10 min, 检测波长570 nm处吸光度 (A) 值, 计算细胞存活率:细胞存活率/%= (实验组A值-调零组A值) / (对照组A值-调零组A值) ×100%。以上实验重复3次。 1.2.4 细胞预冷、离心测定 细胞接种于6孔培养板, 5×106个每孔, 培养24 h后, 加药处理, 使雷公藤甲素的终浓度为25、50、100 nmol·L-1, 继续培养24 h, 显微镜下观察各处理组细胞的变化并拍照, 收集细胞, 2 500 r·min-1, 离心5 min, 洗涤2次;预冷的体积分数为0.75乙醇固定, 4℃过夜。测试前用PBS溶液洗涤2遍, 加PI缓冲液 (5 mg PI、0.1 g Na C6H5、100μl Triton-100、100μl dd H2O) 300μl每管, 避光染色30min, 流式细胞仪检测。 1.2.5 小鼠骨髓细胞培养和sds-表面电泳 将指数生长的CNE-2Z细胞胰酶消化、悬浮、计数, 调节细胞浓度为3×108个·L-1, 接种于6孔培养板, 每孔2 ml, 贴壁培养24 h, 弃培养液, 加药处理24 h后冰上提取细胞全蛋白, 采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。SDS电泳, 转膜;封闭2 h, 加一抗, 4℃孵育过夜;洗膜后加二抗, 室温孵育2 h;Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate试剂盒用Bio-Rad凝胶成像系统获取图像。 1.2.6 细胞ros含量 ROS荧光探针-二氢乙啶 (dihydroethidium, DHE) , 可自由透过活细胞膜进入细胞内, 并被细胞内的ROS氧化, 形成氧化乙啶。氧化乙啶可参入染色体DNA中, 产生红色荧光。根据活细胞中红色荧光的产生, 可以判断细胞ROS含量的多少和变化。将贴壁生长的CNE-2Z细胞用胰酶消化、悬浮, 以5×106个每孔接种于6孔培养板, 贴