地西他滨诱导宫颈癌细胞凋亡分子机制研究.doc

地西他滨诱导宫颈癌细胞凋亡分子机制研究 本文档格式为WORD,感谢你的阅读。 最新最全的 学术论文 期刊文献 年终总结 年终报告 工作总结 个人总结 述职报告 实习报告 单位总结 演讲稿 地西他滨诱导宫颈癌细胞凋亡分子机制研究 目的地西他滨具有较好的抗肿瘤活性，其分子机制与ＤＮＡ去甲基化有关，本研究通过ＤＡＣ对腺瘤性结肠息肉病基因的表达水平和去甲基化的影响，探讨ＤＡＣ诱导宫颈腺癌Ｈｅｌａ细胞凋亡分子机制。方法不同浓度的ＤＡＣ作用于宫颈腺癌Ｈｅｌａ细胞２４、３６和４８ｈ，ＭＴＴ法检测对宫颈癌细胞的增殖抑制作用，观察ＤＡＣ对Ｈｅｌａ细胞增殖的浓度依赖效应和时间依赖效应。流式细胞术检测ＤＡＣ对宫颈腺癌Ｈｅｌａ细胞凋亡和细胞周期的影响。在ＤＡＣ作用于宫颈腺癌Ｈｅｌａ细胞前后，通过甲基化特异性ＰＣＲ检测ＡＰＣ基因的甲基化状态；ＲＴ－ＰＣＲ法检测ＡＰＣ基因ｍＲＮＡ表达水平；蛋白质印迹法检测ＡＰＣ蛋白、β－ｃａｔｅｎｉｎ蛋白在胞内及核内表达的变化。结果ＤＡＣ对宫颈腺癌Ｈｅｌａ细胞增殖抑制具有浓度依赖效应和时间依赖效应，Ｈｅｌａ细胞半数抑制浓度（ＩＣ５０）２４、３６、４８ｈ分别为２８．２３、７．６５和５．６４μｍｏｌ／Ｌ。ＤＡＣ处理后的宫颈腺癌Ｈｅｌａ细胞的凋亡率为（７３．８２±０．１１）％，明显高于对照组的（１２．４１±０．２４）％，Ｐ＜０．００１。ＤＡＣ处理Ｈｅｌａ细胞后，Ｓ期细胞比例（４７．８２±２．５７）％和Ｇ２期细胞比例（３０．８７±２．２８）％显著高于空白对照组的Ｓ期细胞比例（２４．０８±０．７１）％和Ｇ２期细胞比例（２．５２±０．８４）％，Ｐ＜０．００１。ＤＡＣ处理后，ＡＰＣ基因启动子区域去甲基化状态明显增高，ＡＰＣｍＲＮＡ表达量上升，处理前后比较差异有统计学意义，Ｐ＜０．０５。ＤＡＣ处理后，胞内ＡＰＣ蛋白表达上调，而胞内和核内的β－ｃａｔｅｎｉｎ蛋白表达下调，差异均有统计学意义，Ｐ＜０．０５。结论ＤＡＣ可通过对ＡＰＣ基因的去甲基化作用，上调胞内ＡＰＣ蛋白表达，下调胞内和核内β－ｃａｔｅｎｉｎ表达，诱导宫颈癌细胞凋亡。 地西他滨；Ｈｅｌａ细胞；甲基化；凋亡；宫颈癌 宫颈癌是我国最常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均较高。我国宫颈癌的发病率近年来呈年轻化的趋势，严重威胁着女性健康［１］。ＤＮＡ甲基化是表观遗传学改变的主要分子机制之一，目前正受到科学家们的高度重视和关注［２－３］。腺瘤性结肠息肉病基因甲基化水平上调导致的基因功能下调是宫颈腺癌发生的早期事件，具有早期诊断的敏感性和特异性，在肿瘤发生、发展的全过程中稳定存在［４］，通过抑制ＤＮＡ甲基转移酶活性，能够阻断异常ＡＰＣ基因的异常甲基化，导致ＡＰＣ蛋白活性恢复。地西他滨（ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ，ＤＡＣ）是目前临床上常用抗癌药物，也是常见的ＤＮＡ甲基化转移酶抑制剂之一［５］。临床上，ＤＡＣ对急性髓性白血病和慢性髓性白血病等均有明显疗效。ＤＡＣ用于宫颈癌的治疗目前鲜见报道，本研究从分子水平探讨ＤＡＣ对宫颈癌的作用机制，为今后临床应用治疗宫颈腺癌提供新的思路和实验室依据，也可为宫颈腺癌的分子靶向治疗提供理论依据。 １．１主要试剂 ＤＡＣ购自美国Ｓｉｇｍａ公司，细胞凋亡检测试剂盒购自北京四正柏生物公司，鼠抗人ＡＰＣ单克隆抗体购自美国ＲＤ公司，ＰＣＲ试剂盒购自上海生工公司。 １．２细胞培养宫颈腺癌 Ｈｅｌａ细胞，用含１０％ＦＢＳ的１６４０培养基培养，置于温度３７℃、５％ＣＯ２、相对湿度为９０％的恒温培养箱中，进行培养。 １．３ＭＴＴ检测 用０．２５％的胰酶消化并收集生长状态良好的宫颈腺癌Ｈｅｌａ细胞（保证细胞处于单细胞悬浮状态），将细胞调整到约１０４个／孔的密度铺种于９６孔板，每孔体积约２００μＬ，３７℃、５％ＣＯ２培养箱内培养过夜；待细胞密度生长至８０％以上时（一般培养过夜后），加处理因素。设空白对照组和ＤＡＣ处理组，处理组药物浓度设为０．１、１、１０和２０μｍｏｌ／Ｌ４个浓度，每组设４个复孔。在培养２４、３６、４８ｈ时加入ＭＴＴ液２０μＬ／孔，继续培养４ｈ后，将上清液轻轻吸净，再加入ＤＭＳＯ２００μＬ／孔，予振荡摇匀１０ｍｉｎ，待结晶溶解后。酶标仪设定检测Ａ为５７０ｎｍ，测出各孔的吸光度，计算抑制率，并绘制出不同细胞系的生长曲线。 １．４流式细胞术检测细胞周期及凋亡 将人宫颈腺癌Ｈｅｌａ细胞调整为２×１０５ｍＬ－１，接种在６孔无菌培养板中，每个孔共４ｍＬ，Ｈｅｌａ细胞ＤＡＣ的最终浓度为１０μｍｏｌ／Ｌ，每组均设复孔３个，设不加药对照孔。置于３７℃、５％ＣＯ２饱和湿度条件的培养箱内，培养３６ｈ后，收集细胞以进行染色，流式细胞仪测定。 １．５ＭＳＰ检测ＡＰＣ基因甲基化状况 首先按试