食品中过敏原成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第20部分：虾（征求意见稿）.doc

前 言 SN/T ××××的总题目是，由下列部分组成： 1部分：开心果 第2部分：胡桃 第3部分：腰果 第4部分：榛子 第5部分：杏仁 第6部分：巴旦木 第7部分：巴西坚果 第8部分：澳洲坚果 第9部分：栗子 第10部分：羽扇豆 第11部分：葵花籽 第12部分：芝麻 第13部分：芥末 第14部分：花生 第15部分：大豆 第16部分：小麦 第17部分：大麦 第18部分：荞麦 第19部分：牛奶 第20部分：虾 第21部分：胡萝卜 第22部分：芹菜 本部分为SN/T ××××的第××部分。 本部分按照GN/T 1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出。 本部分由全国进出口食品检测标准化技术委员会（SAC/TC445）归口。 食品中成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第部分：范围 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 属节肢动物Arthropoda）甲壳亚门 (Crustacea)，种类很多，包括青虾、河虾、草虾、小龙虾、对虾、基围虾、琵琶虾等。 样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用虾线粒体12S rRNA基因特异性检测引物和探针进行LAMP扩增，通过颜色变化观察判定是否存在过敏原虾成分。 根据虾线粒体12S rRNA基因序列设计特异性内引物、外引物各一对，特异性识别靶序列上的六个独立区域，利用Bst DNA聚合酶启动循环链置换反应，在虾线粒体12S rRNA基因特异靶序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。显色液显色原理：SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green 的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出LAMP反应体系存在的双链DNA数量。 超纯水发生器（分子生物学级别）。 水浴锅或加热模板：65 ℃±1 ℃和80 ℃±1 ℃。 离心管：0.1 mL、1.5 mL。 计时器。 移液枪：量程0.5 μL~10 μL、量程10 μL~100 μL、量程100 μL~1000 μL。 实验用水：应符合GB/T 6682中一级水的规格。 dNTPs溶液：每种核苷酸浓度10 mmol/L。 Bst DNA聚合酶：酶浓度8 U/μL。 10×ThermolPol缓冲液：含200 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、100 mmol/L硫酸铵、100 mmol/L 氯化钾、20 mmol/L硫酸镁、1% Triton X-100。 硫酸镁溶液：50 mmol/L。 甜菜碱：5 mol/L。 显色液：SYBR Green I 荧光染料，1000 ×。 引物： 根据虾线粒体12S rRNA基因设计一套特异性引物，包括外引物F3/B3，内引物FIP/BIP， 见表1。 表1 引物序列 名称 编号 序列 LAMP引物序列 5’- TAGAAACCGACCTGGCTC -3’ 外侧下游引物（B3） 5’- TCATAAGATTAAGTTACTTTAGGGA -3’ 内侧上游引物（FIP） 5’- GCAGCAGTTATAAAGGAAGGTCT-CGGTCTGAACTCAAATCATGT -3’ 内侧下游引物（BIP） 5’- CCTTAATTCAACATCGAGGTCG-ACAGCGTAATCTTCTTTGAGAG -3’ 实验步骤 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置 阴性对照：采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。——提取DNA时设置的提取空白对照（以水代替样品）； ——LAMP反应的空白对照（以DNA溶解液代替DNA模板）。反应体系见表。μL显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混合进入反应液中。 表LAMP反应体系 工作液浓度 加样量（μL） 反应体系终浓度 缓冲液 × 2.5 1 × 外侧上游引物（F3） 5 μmol/L 1.0 0.2 μmol/L 外侧下游引物（B3） 5 μmol/L 1.0 0.2 μmol/L 内侧上游引物（FIP） 40 μmol/L 1.0 1.6 μmol/L 内侧下游引物（BIP） 40 μmol/L 1.0 1.6 μmol/L dNTPs 10 mmol/L 5 2.0 m