第二章核酸分子杂交技术.ppt

第一节 核酸分子杂交的 基本原理 一、核酸分子杂交的基本原理 第二节 探针的制备 （一） DNA探针 1. cDNA探针 以 mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补DNA链 2. 基因组DNA探针 为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列 3.特点 400-500bp，易制备，不易降解，标记方法成熟 较短，17~50个bp，寡核苷酸合成仪合成； 与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列互补，最好不用。 G:C 含量40%-60%； 探针内避免互补；避免同一碱基连续出现； 对靶序列的碱基差异分辨率高；可以区别一个碱基差异的靶序列。 三、探针的标记 为确定探针是否与相应的靶核酸分子杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。 1. 放射性同位素： 3H、32P、35S、125I 灵敏度高；本底低 半衰期短；对人体有害 检测：放射自显影 2. 非放射性同位素： 生物素、地高辛、荧光素 安全性好；灵敏度低； 检测：直接检测、间接检测 （二）标记方法 （二）标记方法 （二）标记方法 第三节 核酸分子杂交的类型 核酸分子杂交分类 液相杂交(soIution hyhridization） 固相杂交 DNA指纹（DNA finger-print）分析： DNA的提纯与纯化→限制性内切酶消化→电泳分离→分子杂交→指纹图的显示 假设一对夫妻，生了一男一女，又领养了一个女孩，妻子还带来与其前夫所生的女儿。这一家人的DNA指纹如图所示。由此可推断出：A和C是亲生儿女；B为妻子和其前夫所生；D为养女 和Southern blot不同在于： 靶核酸是RNA； RNA电泳时，凝胶中加入变性剂，防止　　 RNA分子形成二级结构； 电泳结束后直接转膜 应用：RNA病毒检测、基因表达检测（转录水平） 三、点杂交和狭缝杂交（dot/slot blot） 优点： 可定性定量检测靶序列的存在与否； 没有电泳和转移的过程，操作过程完成较快，便于杂交条件的摸索。 镰状细胞贫血： GAG(Glu)--GTG(Val)? bA probe ACTCCTGAGGAGAAGTCTGCC bS probe ACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC? 将多种探针固定在同一膜上，与标记的受检DNA杂交，称为反向斑点印迹杂交。可一次性筛查出多种不同的序列。 probe 1 2 3 4? 四、原位杂交(in situ hybridization) 原位杂交是将分子杂交与组织化学相结合的一种技术。它是利用标记的已知核酸探针，在组织、细胞及染色体上检测特异的DNA或RNA序列的核酸杂交技术。 小 结 1. 杂交、探针、（荧光）原位杂交的概念。 2. 探针的标记方法。 3. 各种杂交方法的特点。 4. Southern印记杂交的基本过程。 * 核酸分子杂交技术 主讲：金荣仲 一、核酸分子杂交的基本原理 ——DNA的变性与复性 DNA的变性与复性 ——DNA的变性与复性 1/2 1/2 melting temperature Tm 来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补形成异源双螺旋分子，称为核酸分子杂交。 核酸分子杂交 杂交可分成： DNA/DNA RNA/RNA DNA/RNA 一段已知基因（DNA或RNA）核酸序列 用合适标记物予以标记，当作探针 与变性后的单链基因组DNA或RNA进行杂交 再用合适方法把标记物检测出来 可确定靶核苷酸序列是否存在、拷贝数等 诊断基因变异、病原微生物的入侵 * 一、 探针（Probe) : 一段带有检测标记的与目的基因特异互补的已知核苷酸序列。 二、 探针的分类 二、 探针的分类 以DNA为模板转录生成的RNA。 具高杂交效率，但易于降解和标记方法 复杂。 （二） RNA探针 二、 探针的分类 （三） 寡核苷酸探针 ASO1 ASO2 Normal Hetero Homo 三、探针的标记 （一）标记物的选择 三、探针的标记 （一）标记物的选择 地高辛（Digoxin) 毛花洋地黄 1. 随机引物标记法 最常用的DNA探针标记方法 随机引物：6个核苷酸的片段