实验二 蛋白质等电点及含量测定课件.ppt

* 实验二 蛋白质等电点及含量测定 1台可见光分光光度计配套4个玻璃比色杯，用完务必立即洗净、晾干。切忌用试管刷或粗糙布(纸)擦拭。 实验结束后，务必将使用过的玻璃器皿洗净、晾干、放回原处。 【温馨提示】 P40/P51 * 学习蛋白质的两性解离性质，掌握pH值法测定蛋白质等电点的一般原理和操作方法。 学习和掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和操作方法。 【实验目的】 01 蛋白质等电点的测定 * 【实验原理】——pH值沉淀法测定蛋白质等电点 蛋白质是两性电解质，在溶液中存在如下平衡： * 蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点（pI）。在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。 牛乳中的酪蛋白的等电点是4.7-4.8。本实验采用蛋白质在不同pH溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的pH值即为该种蛋白质的等电点值。 【实验原理】——pH值沉淀法测定蛋白质等电点 * 实验仪器 4支15mL玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪（200uL）、枪头（200uL）等。 实验材料和试剂 蒸馏水、1M醋酸、0.1M醋酸、0.01M醋酸、酪蛋白溶液。 【仪器试剂耗材】 ——pH值沉淀法测定蛋白质等电点 * 【操作步骤】——pH值沉淀法测定蛋白质等电点 每小组取4支15mL玻璃试管，按下表顺序分别精确地加入各试剂，加入后立即混匀，加一管，摇匀一管。 管号 H2O /mL 0.01M HAC /mL 0.1MHAC /mL 1M HAC /mL pH 酪蛋白溶液 /mL 观察现象（min） 0 10 20 1 8.40 0.6 - - 5.9 1 2 8.7 - 0.3 - 5.3 1 3 8.00 - 1.00 - 4.7 1 4 7.40 - - 1.60 3.5 1 静置，观察各管在不同时间的混浊度。最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点。观察时可用+，++，+++，表示浑浊度。 * 【实验结果与分析】 ——pH值沉淀法测定蛋白质等电点 观察各管中清澈度变化，记录结果（ 用+，++，+++，表示浑浊度）并解释现象。 确定酪蛋白的等电点。 蛋白质在等电点沉淀的原因是什么？影响该实验结果准确性的因素有哪些？ 【思考题】 02 蛋白质含量的测定 双缩脲法测定蛋白质含量 * 【实验原理】——双缩脲法测定蛋白质含量 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两分子尿素经180℃左右加热，放出1个分子氨后得到的产物。 在强碱性溶液中，双缩脲能与Cu 形成紫红色络合物，称为双缩脲反应。 凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过1个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，可发生双缩脲反应。 2+ * 【实验原理】——双缩脲法测定蛋白质含量 紫红色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，颜色深浅可在540 nm比色测定，故可用此法来测定蛋白质含量。测定的蛋白质浓度范围为1-10 mg/mL。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 * 实验仪器 6支15mL玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪（200uL）、枪头（200uL）、可见光分光光度计等。（绘制标准曲线） 2支15mL玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪（200uL）、枪头（200uL）、可见光分光光度计等。（样品测定） 实验材料和试剂 双缩脲试剂、标准牛血清蛋白、蒸馏水、待测样品（可以用酪蛋白溶液，也可用牛乳中提取的酪蛋白）。 【仪器试剂耗材】——双缩脲法测定蛋白质含量 * 【操作步骤】——双缩脲法测定蛋白质含量 1.标准曲线的绘制。（全班绘制1份即可） 取6支15mL试管，编号0-5，按下表顺序加入各试剂。 试剂/mL 试管 0 1 2 3 4 5 标准牛血清白蛋白 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 蛋白质含量 mg/mL 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 * 【操作步骤】——双缩脲法测定蛋白质含量 上述试剂加完后，充分混匀，室温放置30 min。 以0号管为对照管，于540 nm处比色测定吸光值，记下各管吸光度。 以每管蛋白质含量为横坐标，对应吸光度为纵坐标，作吸光度-蛋白质含量标准曲线。（见电脑桌面Excel表格“标准曲线绘制”）