蛋白质组研究的技术进展.docx

蛋白质组研究的技术进展 基因是遗传信息的纽带，蛋白质是生命活动的执行者。实际上每一种生命运动形式,都是特定蛋白质群体在不同时间和空间出现并发挥功能的结果。因此蛋白质组研究是我们理解细胞功能和疾病发生发展过程的中心环节。如果不能共同致力于蛋白质组的研究,那么基因组的研究成果将无法兑现。DNA序列所提供的信息仅仅是一种静止的资源,而细胞的生命活动是通过各种蛋白质来实现的一种动态过程。一个机体内所有不同的细胞都共享同一基因组,然而同一个机体的不同细胞和不同组织却有不同的蛋白质组,而且机体在不同发育阶段,直至最后消亡的全过程中蛋白质组也在不断交化。因此,蛋白质组要比基因组复杂得多。所以,利用基因组的研究成果进行大规模的蛋白质组研究已经成为必然。 广泛存在基因组中的冗余性是限制遗传手段功能基因研究的巨大障碍。而蛋白组学作为一个技术手段,不受冗余性限制,这是功能基因研究的有力手段。 蛋白质组研究需要有足够的技术支撑,如双向凝胶电泳技术,质谱分析(MS),酵母双杂交系统,蛋白质微阵列技术以及能够进行大规模数据处理的计算机系统和软件等。现阶段蛋白质组的研究可分为3个主要步骤:应用双向凝胶电泳、“双向”高效柱层析分离蛋白质;应用氨基或组成分析、C-或N-末端氨基或序列分析及质谱分析鉴定所分离的蛋白质;应用生物信息学数据库对鉴定结果进行存储、处理、对比和分析。 双向电泳技术是蛋白组学的基本技术,双向电泳的成功与否直接关系到后续操作。实际工作中蛋白质的提取及双向电泳中的一些关键技术常常成为得到好的电泳图谱的制约因素,导致较长时间的重复操作,耗费大量的人力、物力和财力。笔者在双向电泳方面积累了一些工作经验,现整理如下,仅供参考。 1 从样品中提取蛋白质 1.1 适当浓度的蛋白酶抑制剂 蛋白质的提取是双向电泳好坏的最关键的因素。只有好的样品才可能跑出好的电泳图谱。无论采用何种方法提取何种性质的蛋白,千万不要忘记在所提取缓冲液中加入适当浓度的蛋白酶抑制剂(如EGTA,PMSF等),否则不但部分蛋白会丢失,而且很可能在处理和对照的电泳图谱上造成假的差异点,从而导致严重的错误结果。 1.2 把样品转移到离心管内 在样品研磨后要转移到离心管中,这也是蛋白丢失的一个关键步骤,因为样品的研磨一般采用液氮进行,而在转移过程中样品往往会部分粘在管口而不能完全转移到离心管内,笔者的经验是在转移前,先把离心管和转移样品的用具在液氮中冷冻一下,就能使样品非常容易的转移进入离心管而不会粘在管口、管壁和转移所用用具上。 1.3 a.不同聚焦方法 样品中的离子浓度过高会造成双向电泳的第一向等电聚焦电泳不能很好的聚焦,影响分离效果(如图1)。所以一般用丙酮来沉淀蛋白清洗离子,清洗时,丙酮中一般要加0.3%的DTT来尽量消除丙酮可能造成的蛋白的甲基化,而且清洗要彻底,一般3次以上。 1.4 变性剂溶解法 溶解的目标:(1)完全破坏样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体,从而形成各个多肽的溶解液(否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点,相应的表示单个多肽的点的强度会下降);(2)溶解方法必须去除可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质;(3)溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。变性剂可通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展,将其疏水中心完全暴露,降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫脲。 表面活性剂经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后,还常需要至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。 在变性剂和表面活性剂联用条件下,加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全,溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或b-巯基乙醇,以及不带电荷的三丁基膦(TBP)进行还原。 推荐使用的蛋白溶解液是:7M尿素,2M硫脲,2%CHAPS,1%DTT和2%两性电解质。 1.5 样品储存 蛋白质溶解后,可于-20℃保存,一定注意不能反复冻溶,否则会造成蛋白的降解。 2 人才培养时间的确定 聚焦步骤可根据不同的样品选择,一般采用所选IPG干胶条的说明再结合实验进行选择。对于聚焦时间,理论上讲,要获得最好的图谱质量和重复性所需最佳时间是IEF分离达到稳定态所需的时间。聚焦时间太短,会导致水平和垂直条纹的出现。过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移,但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出(电渗)而造成蛋白图谱变性,在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失(图2,3)。 3 维电泳胶条的平衡 一维结束后可马上进行二维电泳,也可保存在两片塑料膜间于-80℃保存数月。但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡,以便于被分离的蛋白质与SDS