华农基因工程实验介绍.doc

实验报告 实验项目名称：基因工程综合实验 实验项目性质：综合性实验 所属课程名称：基因工程 班 级：11生物工程1班 学 号：秋叶 指 导 老 师 ：陈忠正 实验完成时间：2014年5月11日 目录： 摘要 ..................................................3 前言 ..................................................3 实验材料和仪器................................................3 2.1 实验材料 2.2实验仪器 . 实验试剂 ..........................................4 3.1 DNA提取所需试剂 3.2 PCR实验所需试剂 3.3 双酶切实验所需试剂 实验步骤 ...........................................4 4.1 质粒DNA提取 4.2 聚合酶链式反应（PCR） 4.3 质粒DNA的双酶切分析 4.4 琼脂糖凝胶制备 实验结果与分析 ...........................................7 5.1质粒DNA提取所得凝胶电泳结果 5.2 PCR扩增实验结果 5.3质粒DNA的双酶切分析结果 摘要：实验包括质粒DNA的提取、DNA的凝胶电泳、质粒DNA中靶基因的酶切分析及质粒DNA中重组进的靶DNA序列的PCR扩增。通过本综合实验，帮助大家理解质粒DNA的提取原理、凝胶电泳中DNA分离的机理、限制性内切酶的工作原理及PCR是如何实现DNA扩增的，通过实验同时让同学掌握DNA的提取技术、凝胶电泳技术、DNA酶切分析技术及靶基因的体外快速扩增技术，了解实验中出现的现象并学会分析与解决实验中出现的有关问题。 聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。α（含重组了约1000bp DNA片断的PET32.a表达质粒，Amp抗性） 2.2 实验仪器 高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪、小三角瓶、PCR仪、微量移液器、冰盒、制胶模、电泳仪。 3 实验试剂 3.1 DNA提取所需试剂 3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA（10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖 溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA pH8.0 ； 溶液Ⅱ： 0.2 mol/L NaOH， 1%SDS w/v ，现配现用； 溶液Ⅲ：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH值至5.2； 3.2 PCR实验所需试剂 实验一提取的质粒DNA，0.5U/μL的 Taq酶及5 × PCR buffer、1 mmol/L 的dNTP、克隆基因特异引物PF、PR（各1μmol/L），0.2mL的PCR管，TIP头，goldview DNA染色剂，琼脂糖，10×上样缓冲液，0.5×TBE、marker DNA等。 PCR扩增引物： PF：5`—CTCGGATCCATGGAGCTAGCTACTGCGGG—3` PR：5`—CCGGTCGACTCCATCAATCTTGGAAAGCA—3` 3.3双酶切实验所需试剂 实验一提取的质粒DNA，BamHI（3 U /μL），HindⅢ（3 U /μL），1.5mL的EP管，TIP头，goldview DNA染色剂，琼脂糖，6×上样缓冲液，0.5×TBE等。 4 实验步骤 4.1 质粒DNA提取 4.1.1取1mL菌液放入Ep管中，12000 r/min（简写rpm）离心1min；弃尽上清；（注：先倒液体入废液缸，再倒扣用吸水纸吸干液体，残留液体可移液器吸干） 4.1.2加入200μL预冷的含RNaseA的溶液I，旋涡以充分混匀； 4.1.3加入200μL的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静置5min以充分裂解细菌； 4.1.4加入200μL的溶液Ⅲ，温和混匀，－20℃放置8min（常温也可，但产量可能下降），12000rpm离心5min；吸上清至另一新的1.5m