【2017年整理】基因工程实验手册.doc

《本科实验教学》 基因工程实验指导 贵州大学农业生物工程研究院 2015年4月 实验一DNA片断的连接、转化及酶切鉴定 一、实验原理： 实验所用载体为Promega公司T载体pGEM?-T Easy Vector，特点为在载体中存在两个T末端。 使用LA Taq进行扩增得到的大部分PCR产物3’端附有一个“A”碱基。 T4噬菌体DNA连接酶可在体外使外源DNA片段和线状质粒载体之间形成新的3，5磷酸二酯键。PCR胶回收产物游离A末端与载体的T末端可互补配对并在连接酶作用下连接形成重组质粒。 转化指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA分子导入受体细胞体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。大肠杆菌转化常用化学法（CaCl2法），其原理是培养至对数生长期的细菌0℃经过低渗CaCl2溶液，抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时处理，促使细胞，。本实验中本身具有Amp抗性 对培养的含有大量质粒的菌液，离心收集菌体。用含有一定浓度葡萄糖的缓冲液（溶液Ⅰ）悬浮菌体，采用碱性SDS（十二烷基硫酸钠）溶液裂解菌体的细胞壁，使质粒缓慢释放出来，同时整个液体的pH为12-12.5，双链DNA变成单链，当pH调至中性并有高盐浓度存在下，绝大多数变形质粒恢复自然状态溶在液体中，而变形染色体不能复性，断裂呈线性的单链细菌染色体DNA 相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上与蛋白质形成沉淀，离心获得含有大量质粒的上清液，再利用适当浓度的亲水性有机溶剂（乙醇、异丙醇）使质粒DNA脱水，离心等到质粒沉淀。 限制性内切酶能识别并切割特异位点的DNA序列。其被广泛应用于载体构建。的质粒DNA，利用限制性内切酶EcoR I（GAATTC）进行酶切，可将目的基因切下。酶切结果可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。 pGEM?-T Easy Vector（Promega）α感受态细胞 三、实验仪器 PCR仪、制冰机、水浴锅、37℃摇床、离心机、涡旋振荡器、电泳槽 四、实验试剂 SolutionⅠ（0-4℃保存）:50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L Tris·Cl(pH8.0)；10mmol/L EDTA(pH8.0) SolutionⅡ(现配现用):0.2mol/LNaOH；1% SDS SolutionⅢ（0-4℃保存）:0.2mol/L KAC 60mL；冰乙酸 11.5ml；ddH2O 28.5ml(pH4.8) Rnase: 100mg Rnase粉剂，溶于10ml 10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl缓冲液中，水浴煮沸15min,冷却，－20℃保存。 五步骤L pGEM?-T Easy Vector 1.0μL PCR产物 3.0μL T4 DNA连接酶 1.0μL ddH2O 4.0μL 用移液枪吹打连接反应使之混匀后，4℃孵育过夜。 2.连接产物转化大肠杆菌 （1）（2）L感受态细胞至新的1.5mL离心管中。 （3）向感受态细胞中加入0.1ng-10ng（约7ul）转化用DNA，轻轻混匀后冰中放置30min。 （3）4245s后，立即冰中放置2min。 （4）加入890μL 37℃预温的LB培养基。 （5）37℃,200rpm振荡培养1h，4000×g，室温离心1min。 （6）倒掉上清，向沉淀中加入100μLLB液体培养基后充分混匀，取30μL悬浮菌液涂布于LB抗性平板（2% X-Gal：40μL；24mg/mL IPTG：7μL；100mg/mL Amp：30μL）。 （5）3712-16h，挑选白色单菌落扩增培养。 3.质粒DNA的提取 （1）将含有目的基因的阳性克隆mL离心管中，10,000×g，4℃，离心1min，倒掉上清液。重复操作L的SolutionⅠ，涡旋震荡，直至没有沉淀。 （4）加入200μL SolutionⅡ，轻柔的上下翻转离心管数次，使之混匀，冰中放置3min（加入SolutionⅡ后在冰上放置不要超过5min）。 （5）加入150μL SolutionⅢ后立刻混匀，冰中放置3min。 （6）100rpm，4℃，离心10min，将上清液转移到另一离心管中。 （7）加入2倍体积的无水乙醇（约700μL），颠倒离心管数次以混合，-20℃放置20min。 （8）10,000rpm，4℃，离心10min，弃上清液。 （9）加入1mL 70%乙醇洗涤DNA沉淀。 （10）去掉上清液，倒扣于吸水纸上几分钟，在空气中使沉淀干燥或真空抽干，干燥的标志为白色沉淀变为半透明或透明。 （11）加入18μL ddH2O溶解沉淀，加2μL RNase（100?g/mL），使RNA酶终浓度为20?g/mg，振荡，37℃度保温40分钟。 （12