量反应平行法测定低分子肝素抗凝血酶的研究.docx

量反应平行法测定低分子肝素抗凝血酶的研究 低分子肝素是糖乙酸与葡萄糖乙酰化和硫酸化结合产生的二氧化葡萄糖。作为一种抗凝药物，广泛应用于临床实践。它具有很高的生物利用性，不需要专门的临床监测。它不仅是一种重要的术后预防和治疗静脉血栓形成（dvt），也是治疗心血管疾病和癌症的重要药物。在欧洲和美国，药物被用来代替非分类肝脏（ufh）。国内已有10家企业生产LMWH(四类新药),并面临新药转正。新版英国药典(british pharmacopoeia,BP) 2003除收载总的LMWH外,还根据其生产工艺(将UFH亚硝酸降解、亚硝酸降解后去除小于相对分子质量(Mr)2000的组分、β-消除降解、过氧化物降解、肝素酶降解等)不同造成还原端和非还原端的结构不同将LMWH细分为5类,它门的Mr、及Mr分布和硫酸化程度不同,与之相应的生物活性(抗-FⅩa、抗-FⅩa与抗-FⅡa的比率)也大不相同,质量标准各异,除必须符合LMWH总则外,还应符合各论,尤其对杂质的要求;生物活性(抗-FⅩa和抗-FⅡa)的测定方法被收载于总则中。 抗-FⅩa、抗-FⅩa与抗-FⅡa的比率是质量标准中的重要指标之一,国产10家企业LMWH的企业质量标准不同,生物活性测定方法各异,而由于国内企业生产工艺多为亚硝酸降解法,属同一类品种,因此应统一标准,制定LMWH国家标准迫在眉睫。本文将国产LMWH的新药转正标准制定中的生物活性测定方法进行了比较研究,得出较准确、可靠的结论。 1 lmwh钙的合成 日立U-3310紫外分光光度计(日本)。标准品(standard,S):LMWH欧州药典参考品,抗-FⅡa44.2 IU·mL-1和抗-FⅩa 106.1 IU·mL-1。供试品(tested,T):LMWH钙注射液(生产厂A、B、C,规格分别为抗-FⅩa 5000IU·0.5 mL-1·支-1、6150IU·0.6mL-1·支-1、5000 IU·1mL-1·支-1);注射用LMWH钙(生产厂G,抗-FⅩa5000IU·支-1);LMWH钠注射液(生产厂D、E、F,均为抗-F Xa 5000IU·1 mL-1·支-1,生产厂H、I,规格为抗-FⅩa 5000IU·0.5 mL-1·支-1);注射用LMWH钠(生产厂J,抗-FⅩa5000IU·支-1)及生产厂A、B、G的LMWH钙原料。抗凝血酶(antithrombin,AT)10 IU·瓶-1、FⅩa 71nkat·瓶-1、发色底物S-2765(N-a-benzyloxycarbonyl-D-arginyl-L-glycylL-arginine p-nitroanilide dihydrochloride) 25 mg·瓶-1、S-2238 (H-D-pHenylalanyl-L-piperazinearginine p-nitroanilide dihydrochloride) 25 mg·瓶-1均为意大利Chromogenix公司产品(广东天普生化医药股份有限公司代理);凝血酶国家标准品580 IU·瓶-1(中国药品生物制品检定所)。 2 糖链及凝血酶抑制剂的作用 其原理为LMWH与ATⅢ形成复合物,其中小于18个糖链的LMWH的复合物,抑制了FⅩa与发色底物S-2765的水解反应;而大于18个糖链的LMWH与ATⅢ的复合物,同时结合凝血酶即FⅡa形成三元复合物,抑制了FⅡa与发色底物S-2238的水解反应;水解反应都生成显色的对硝基苯胺,LMWH的抗-FⅩa或抗-FⅡa活性与对硝基苯胺的量成反比从而测定其效价(potency,PT)。 2.1 s1s3s3s4t1t3t3t4t3t4t3t3s3s4的生物活性 该实验设计为标准品(S1-S4)与供试品(T1-T4)各4个浓度的稀释液,每一浓度做2支平行管,排列顺序:S1S2S3S4T1T2T3T4T1T2T3T4S1S2S3S4,显色反应与BP一致,反应终止后,405nm波长处测其吸收度作为反应值,反应值与log浓度间按生物检定统计法中的4·4法(有生物统计软件)计算抗-FⅩa或抗-FⅡa的PT和实验误差的平均可信限率(percent of fiducial limit of error,FL%)。 2.2 抗-fa及抗-fa的pt S有4个浓度的稀释液,T只1个浓度稀释液,每一浓度做2支平行管,按BP显色反应步骤操作,反应值与log浓度间回归计算标准曲线,T测得反应值一点插入求出抗-FⅩa或抗-FⅡa的PT。 3 抗-fa的pt 比较S与T在体外延长全血或血浆的凝结时间的程度来决定T的抗凝血酶(抗-FⅡa)的PT。本实验室按中国药典(ChP)2005年版二部收载的兔血浆法和兔全血法,实验设计均为量反应平行线3·3法测定抗-FⅡa的PT。血浆法FL%在5%以内;