僵蚕抗凝血酶诱导血管内皮细胞释放作用探究.doc

僵蚕抗凝血酶诱导血管内皮细胞释放作用探究摘要：目的：研究僵蚕抗疑血酶诱导血管内皮细胞释放作用的影响。方法：将不同浓度的僵蚕注射液(600μg/mL，300μg/mL，150μg/mL)加入凝血酶诱导的血管内皮细胞中，培养12 h后收集细胞液，观察不同浓度的僵蚕注射液对凝血酶诱导血管内皮细胞释放作用的影响。结果僵蚕大、中、小剂量组较凝血酶组均能明显增加组织型纤溶酶原激活物(t－PA)活性，分别为(0.460±0.010)U/mL，(0.457±0.019)U/mL，(0.366±0.014)U/mL(P＜0.01)；同时也可降低纤溶酶原活化素抑制物(PAI)活性，降低血管性假血友病因子(yWF)含量，与凝血酶组比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。结论：僵蚕注射液可以明显抑制凝血酶诱导的内皮细胞释放作用，此作用与僵蚕的抗疑作用有关。 关键词：僵蚕注射液；血管内皮细胞；疑血酶 中图分类号：R392.5 R289.5　文献标识码：A　文章编号：1672－1349(2007)09－0837－03 僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕(Bombyx mon，L)4龄～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌[Beauvcna bassiana(Bals)Vaill]而致死的干燥体，为传统中药，又名白僵蚕。早在《神农本草经》中已有记载，味辛、咸，性平，具有祛风定惊、活血通络、化痰散结等功效。应用涉及到心脑血管、肝、肾和血液病等。在对僵蚕抗实验胜静脉血栓及药理作用研究中发现，僵蚕水提液体内外实验均具有较强的抗凝作用。本实验通过比较不同浓度僵蚕注射液对凝血酶诱导血管内皮细胞释放组织型纤溶酶原激活物(i－PA)、纤溶酶原活化素抑制物(PAI)，血管性假血友病因子(ywF)的影响，阐述僵蚕注射液对凝血酶诱导的内皮细胞释放作用的影响及作用机制。 1　材料与方法 1．1　材　料 1．1．1　脐静脉细胞：新生儿脐带静脉血由湖南中医药大学第一附属医院妇产科提供。 1．1．2　药物：僵蚕由湖南中医药大学附一院药剂科提供，制备僵蚕注射液：僵蚕匀浆化小煎，醇沉，制成注射液。pH值7.4，含量相当于2 g/mL。 1．1．3　仪器CO2培养箱(美国Format Screntific Co产品)，倒置相差显微镜(中国上海显微镜厂产品)，Multiscan酶标仪(日本Epaan公司产品)。 1．1．4　试剂t－PA，PAI，yWF及凝血酶试剂盒均由上海太阳生化公司提供。 1．2　实验方法 1．2．1　内皮细胞的培养与鉴定：取新生儿脐带静脉，采用0.25％胰蛋白酶消化和机械性刺激获取脐静脉内皮细胞，原代培养。经Ⅷ因子免疫荧光检查并选用生长良好的第2代～第5代内皮细胞用于实验。 1．2．2　实验分组：收集对数期细胞，调整细胞浓度接种于96孔培养板中，置37℃、5％CO2培养箱中培养，待培养24 h－48h后培养板内已有80％的细胞呈汇合状态时，加药进行实验。实验分5组：凝血酶(5.0 kU/L)组，僵蚕大剂量组(凝血酶5.0kU/L+僵蚕600μg/mL)，僵蚕中剂量组(凝血酶5.0 kU/L+僵蚕300 μg/mL)；僵蚕小剂量组(凝血酶5.0 kU/L+僵蚕150μg/mL)，以及无凝血酶及僵蚕的空白对照组。每组实验做6个重复孔，培养12 h。 1．3　测定指标与方法t－PA，PAI活性测定均用发色底物法，yWF含量测定用酶联免疫吸附双抗体夹心法。严格按试剂盒说明书进行操作，PAI活性用抑制单位每毫升(AU/mL)表示。 1．4　统计学处理：计量资料以均数上标准差(X±s)表示，数据处理采用SPSS 12.0统计软件作力差分析和直线回归及t检验，P0.05为差异有统计学意义。 2　结　果 2．1　僵蚕对凝血酶诱导血管内皮细胞释放PAI，t－PA，yWF的影响僵蚕大、中、小剂量组均能明显增加t－PA活性，降低PAI活性，降低yWF含量，与凝血酶组比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。 2．2　僵蚕对凝血酶诱导血管内皮细胞释放反应的影响程度按下列公式计算：影响率=(凝血酶加僵蚕组－凝血酶组)/(凝血酶组空白组)×100％。 僵蚕小、中、大剂量组对凝血酶诱导血管内皮细胞释放t－PA的影响率分别为55.1％，95.6％，96.8％，对PAI的影响率分别为29.3％，85.4％和92.5％，对yWF的影响率分别为67.9％，93.1％与94.8％。结果显示，僵蚕大剂量组对凝血酶诱导血管内皮细胞释放t－PA具有明显促进作用，同时对PAl和yWF的释放具有明显抑制作用。 3　讨　论 近年来研究表明，血栓形成机制与血管内皮细胞、血小板、抗凝、纤溶机制密切相关。凝血酶不但使纤维蛋白原