基因组文库和cDNA文库的构建及筛选.pdf

中国试剂网 3.20.1.11 基因组文库和cDNA 文库的构建及筛选 刘芝华 中国医学科学院肿瘤研究所 分子肿瘤学国家重点实验室 概念： 基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA 克隆群体；cDNA 文库是指含有所有重组cDNA 的克隆群体。 基因组文库：来源于基因组 DNA ，反映基因组的全部信息，用于基因组物理图 谱的构建，基因组序列分析，基因在染色体上的定位，基因组中基因的结构和组 织形式等。 cDNA 文库：来源于细胞表达出的 RNA ，反映基因组表达的基因序列信息，用 于研究特定细胞中基因的表达状态和表达基因的功能等。 基因文库＝基因组文库＋cDNA 文库 载体的种类和特征： 受体细胞 结构 插入片段 举例 质粒 E.coli 环状 很小，8kb pUC18/19 ,T-载体, pGEM3z λ噬菌体 E.coli 线状 9-24kb EMBL ，λgt 系列 丝状噬菌体及E.coli 环状 10kb M13 系列 噬菌粒 粘粒载体 E.coli 环状 35-45kb BAC E.coli 环状 约300kb PAC E.coli 环状 100-800kb PCYPAC YAC 酵母细胞 线性染色体 100-2000kb MAC 哺乳动物细胞 环状 1000kb 病毒载体 动物细胞 环状 SV40 载体，昆虫杆状 病毒载体 穿梭载体 动物细胞和细环状 pSVK3 质粒，PBV,Ti 中国试剂网 3.20.1.11 菌 质粒， · DNA 的制备：高分子量的外源DNA 100-150kb · 剪切：随机切割 · 载体： l 噬菌体：48.5kb, 插入型(最多可容纳 9kb) 、取代型(可容纳 38-51kb ，最适 19-20kb)， EMBL, Charon 粘性质粒(Cosmid) ：4-6kb, 质粒+噬菌体的性质，可容 纳大片段的外源基因，最多可容纳46kb 。 酵母人工染色体克隆体系（YAC ，Yeast Artificial Chromosome Cloning System ） 插入大小200—1000kb · 载体DNA 的制备： 载体DNA 酶切反应载体臂的纯化载体脱磷处理 （常用BamHI ） （蔗 糖密度梯度离心） （碱性磷酸酶） · 连接和包装：外源片段与两臂之间的比例，包装蛋白 · 感染宿主菌：选择合适的宿主菌，LE392, NM538, NM539, KW251 等 · 基因组文库的保存和扩增：完整性和代表性 测滴度，要在106fu 以上; 保存，氯仿4 ℃，7% DMSO -70℃ cDNA 文库的构建 · 分类：按表达类型分：表达型、非表达型 按载体类型分：质粒cDNA 文库、噬菌体cDNA 文库 · 关键：mRNA 的获得。完整、种类多、不能降解。电泳应在0.5-8kb 之间。已 知探针做Northern 或PCR 。 · 反转录：AMV 鸟成髓细胞性白血病病