第十五章动物干细胞技术.ppt

3、基因和细胞治疗 细胞治疗是指用遗传工程改造过的人体细胞直接移植或输入病人体内，达到治愈和控制疾病的目的。 目前基因治疗中存在的问题 (1)导入基因的整合和表达难以控制 (2) 用作基因操作的细胞在体外不易稳定地被转染和增殖传代等 ES细胞的优越性：具自我更新能力,经遗传操作后仍能稳定地在体外增殖传代。以ES细胞为载体，经体外定向改造，使基因的整合数目、位点、表达程度和插入基因的稳定性及筛选工作等都在细胞水平上进行，容易获得稳定、满意的转基因ES细胞系 用于治疗神经性疾病、心肌缺损、风湿性关节炎、糖尿病等 用骨髓干细胞治疗糖尿病 骨髓干细胞（绿色）诱导白鼠胰腺（红色）中胰岛素的再生。50微米尺度。 4、器官培养 可以利用存在于健康组织的干细胞修复或再生受损组织 利用ES细胞培养出的肺 这是第一次利用从患者的骨髓里提取的成熟干细胞培养新组织或者器官，用于移植 利用ES细胞培养出的心脏 研究人员利用干细胞培育出血管细胞和心肌组织细胞，并将两者相混合，由此产生的“补丁”心肌组织就拥有了丰富的血管网络，可以保证血液的正常输送，从而得以生存并拥有充足的营养 利用ES细胞培养出可植入的乳房组织 利用自体脂肪干细胞来生成植入物，以替代目前广泛使用的硅胶假体和盐水假体。 谢谢大家！ 三、饲养层细胞培养法 定义： 在细胞培养中起分化抑制作用的单层贴壁细胞 所谓滋养层细胞就是指一些特定细胞（如颗粒细胞、成纤维细胞、输卵管上皮细胞等已在体外培养的细胞），经有丝分裂阻断剂（常用丝裂霉素）处理后所得的细胞单层。是细胞培养，尤其是胚胎干细胞培养常用的生长增值促进剂和分化抑制剂。 （一）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） 作用：能有效促进胚胎干细胞增殖并维持其未分化的二倍体状态和全能性（LIF、bFGF） 优点： 取材容易，价格低廉，分泌效果好 缺点： 不能在体外长期传代，不能用于转染外源基因的胚胎干细胞的筛选 STO T O S SIM小鼠胚胎 硫代鸟嘌呤 鸟本苷有抗性的成纤维细胞系 作用：分泌SCGF、LIF 2、STO细胞 1、MEF的分离与培养 2、MEF饲养层的制备 （二）MEF饲养层细胞的制备 四、无饲养层培养 1、原理 : 在细胞培养液中添加ES细胞抑制因子使ES细胞在体外培养环境下保持未分化状态 2、培养方法 扩张囊胚或孵化胚 分离ICM细胞 挑取形态典型的ICM集落 转入ES细胞培养液中进行剥离 转入培养基进行培养 实体显微镜下 用0.25％胰酶和0.04％ EDTA消化液消化3~5min 用孔径适当的吸胚管吹打成单细胞或小细胞团块 制备好MEF饲养层并添加相应的ES细胞培养液，隔日将囊胚置入培养（37℃、5%CO2和饱和湿度）。离散的ICM或ES细胞重新接种饲养层后，可出现各种细胞集落，挑选生长良好，没有分化迹象的ES/EG集落进行消化扩增。用胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团并继续培养，一般间隔4～5天用胰蛋白酶消化成小细胞团块或单细胞，克隆和纯化ES细胞。ES/EG的亚克隆对外界条件的要求十分苛刻，如PH，酶，温度，培养液成分，细胞密度以及冷冻复苏等体外不稳定环境因素均影响着ES细胞的分离和克隆。 五、ES细胞的原代培养和继代培养 （二）、ES细胞的继代培养 初次传代后2～3天将出现小的ES细胞集落。待ES细胞集落充分增值而不出现分化时重新离散，转入新鲜饲养层上。经数次分离纯化后，ES细胞逐渐扩增，后面每隔4～6天传代一次。对ES/EG细胞进行消化传代总的原则是尽量缩短酶消化作用时间，将细胞的损伤降到最低程度且能将集落消化成小细胞团块（图15-3）。 （三）、ES细胞的冷冻与解冻 在ES细胞传代过程中，因其耐受性差需不断对细胞行冷藏。方法为取对数生长期的ES单细胞悬浮液放入冷冻液中。冷冻液为75%DMEM+15%新生牛血清（NCS） +10%二甲基亚砜（DMSO）冷冻开始温度下降速度保持在13℃/min为宜，当温度下降到-20℃左右时下降速度可调为5℃/min,到-100℃左右时，可迅速投入液氮。 解冻时，从液氮中将冷冻管取出───37℃水浴中直到溶解───70%的酒精消毒冷冻管外壁──加入ES细胞培养液离心2次除去冷冻液──弃去上清液，以培养液重新悬浮细胞───再放入CO2培养箱培养。 六、ES和EG细胞系的特性和鉴定 （一）ES∕EG细胞系的特性 1、无限增殖性 2、分化潜能性 3、种系传递性 1、无限增殖性：在不分化的前提下，ES细胞体外增殖迅速，每18~24h增殖一次。增殖过程中细胞大多处于S期，进行DNA