神经系统遗传病的基因诊断__培训课件.ppt

遗传病治疗 基因治疗的发展为遗传病治疗带来了新的希望。 基因治疗是一种用正常或野生型基因导入靶细胞，校正或置换致病基因的治疗方法。 参考书 梁秀龄.神经系统遗传性疾病.人民军医出版社，2001. 曾溢滔.遗传病的基因诊断与基因治疗.上海科学技术出版社，1999. 谢 谢！ 2、第三代遗传标记—单核苷酸多态性(SNP) 某些DNA位点上，单个碱基存在着变化。如： AATGGCGTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCAGCT AATGGCCTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCTGCT AATGGCATAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCGGCT 个体A 个体B 个体C SNP分布于整个基因组，可在基因内，也可在基因间。估计每1000个bp存在一个。 在人类DNA序列变异中，SNP占90%。 单个碱基的插入和缺失不认为是SNP。目前已知基因组中含有150万个SNP 芯片杂交结果示意图 A C G T 位点1 位点2 位点3 常用检查方法：DNA测序、芯片杂交等。 常用技术 等位基因特异性寡核苷酸杂交（allele-specific oligonucleotide，ASO ） 当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide，ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时需要合成两种或两种以上的探针，一种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来. PCR可结合ASO，即PCR－ASO技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。 异常探针 T A G 正常人 患者 DNA DNA 点杂交 正常探针 G A G 正常人 患者 DNA DNA 点杂交 单链构象多态性PCR (SSCP-PCR) DNA分子在电泳中的行为取决于分子量 和分子构象。 DNA单链的构象取决于序列。 PCR产物变形后于中性胶中电泳，与正常 对照比较，若电泳行为异常，则认为内含 突变的碱基。 对照 实验 等位基因特异性PCR(Allele-Specific PCR, AS-PCR) 利用末端突变的引物进行PCR。 实际应用中，常使用三个引物： A3’ 5’ G3’ 5’ 5’ 3’ 正常上游引物 正常下游引物 突变上游引物 使用正常引物，在正常人有扩增，异常人无扩增。 使用突变引物，在异常人有扩增，正常人无扩增。 （严格条件下的PCR） A C G T A T G G T A C C G C A T 染色体FISH探针 整条染色体涂染探针 染色体重复序列探针 染色体专一位点探针 基本过程： 1、染色体标本制备 2、探针制备 3、杂交 4、显微观察（染色体分带） 整条染色体涂染 通过整条染色体涂染判断易位染色体 引物原位标记技术(Primed in situ Labeling, PRINS) 针对染色体的特异性α-卫星DNA 序列设计和合成引物。 利用未标记的寡核苷酸引物与变性后的染色体DNA特异结合, 然后用荧光素标记的脱氧核苷酸(dUTP)与未标记的脱氧核苷酸一起在DNA聚合酶的作用下进行延伸反应,标记了的dUTP将以碱基配对的形式掺入到新合成的DNA单链中, 最后用相应的荧光抗体与标记物结合以显示检测结果。 举例1 DMD／BMD的缺失型诊断： DMD／BMD是一种Ⅹ连锁隐性遗传的神经肌肉系统受累的致死性遗传病。 DMD／BMD有70％左右为缺失型。 此基因很大，缺失可发生在不同部位，因此应尽可能采用多对引物作PCR扩增（多重PCR）来检测。如扩增产物电泳后发现有带纹的缺失，即可作出诊断并对缺失定位。 在进行产前诊断时，一般可先通过检测家系中有关成员，即确定先证者的缺失区，然后有针对性地作PCR扩增，包括缺失部分的两端，以判断胎儿或有关患儿是否也获得了相同的基因缺失，但非缺失型不能用此法查出。  举例2 脊肌萎缩症（SMA） 5q13.1 SMN1,SMN2 举例3 Huntington’s Disease (HD) IT15 （CAG）n 举例4 腓骨肌萎缩症（CMT） Hereditary motor and sensory neuropathies a c