荧光检测神经递质氨基酸.pptx

荧光检测器在测定生物基质 氨基酸含量中的应用 目录 荧光的概念： 当紫外线照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色不同强度的可见光，而当紫外线停止照射时，所发射的光线也随之很快消失，这种光线被称为荧光。 历史： 西班牙的内科医生和植物学家N. Monardes第一次记录了荧光现象 1575年 1852年 Stokes在考察奎宁和叶绿色的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍长，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，从而导入了荧光是发射光的概念。他还是第一个提出应用荧光作为分析手段的人（1864年）。 1867年 Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作。 1864年 Liebeman提出了最早的关于荧光与化学结构关系的经验法则。 1928年 Jette和West研制出第一台光电荧光计，灵敏度非常有限。 1948年 Studer推出第一台自动光谱校正装置。 1952年 实现商品化。 50年代 初期 极少数分析化学工作者从事荧光分析方面的工作 70年代后期 引起了国内分析界广泛重视 物质在吸收入射光的过程中，光子的能量传递给了物质分子。分子被激发后，发生了电子从较低的能级到较高能级的跃迁。跃迁所涉及的两个能极间的能量差等于所吸收光子的能量。紫外、可见光区的光子能量较高，足以引起分子中的电子发生电子能级跃迁。 处于激发态的分子不稳定，可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁的衰变过程而返回基态。辐射跃迁的衰变过程伴随着光子的发射，即产生荧光或磷光。 由第一电子激发单重态所产生的辐射跃迁而伴随的发光现象称为荧光。 荧光的原理 荧光 激发的单重态 激发的三重态 荧光的激发光谱和发射光谱 激发光谱： 发射光谱： 固定荧光的发射光谱（即测定波长）而不断改变激发光（即入射光）的波长，并记录相应的荧光强度所得到的荧光强度对激发波长的谱图。 使激发光的波长和强度保持不变，不断改变荧光的测定波长（即发射波长）并记录相应的荧光强度所得到的荧光强度对发射光波长的谱图。 可作为进行荧光测定时选择合适的激发波长和测定波长的依据。 激发光（即入射光） 测定波长（即发射波长） 化合物溶液的发射光谱特征： 1、所观察到的荧光的波长总是大于激发光的波长——斯托克斯位移 2、发射光谱的形状通常与激发波长无关，通常只含一个发射带。 3、与吸收光谱呈镜像关系 荧光强度与溶液浓度的关系： If=2.303YfI0εbc 注意：当溶液浓度足够小使得对激发光的吸光度很低时，所测得溶液的荧光强度才与该荧光物质浓度成正比。 浓度达到一定程度，荧光强度随着浓度的增大而下降。 浓度效应： 可能原因： 1、内滤效应 ①杂质吸收 ②前面吸收多 2、溶质间的相互作用 激发/基态二聚物 3、发射光谱和吸收光谱呈现部分重叠。 荧光分析的灵敏度和选择性： 灵敏度： 1、比比色法和分光光度法高2-3个数量级。 2、加大激发光的强度，可以增大荧光强度从而提高分析的灵敏度。 3、灵敏度可达亿分之几。 4、接近单分子检测水平。 选择性： 1、可以选择适当的激发波长和荧光测定波长达到选择性测定的目的。 2、荧光特性参数较多，还有荧光寿命、荧光偏振等。 荧光表征： 许多化合物由于本身具有大的共轭体系和刚性的平面结构，因而具有能发射荧光的内在本质，我们称这些化合物为荧光化合物。 具有荧光团的物质，我们可以通过检测某种荧光特性参数的变化而对该体系的某些性质加以研究。 对于不含荧光团或内源荧光性质很弱的物质我们可以加入一种荧光化合物（荧光探针），再通过测量荧光探针的荧光特性的变化来对该体系加以研究。 例：用对pH敏感的荧光探针检测pH。 荧光检测器在体内药分中的应用 Quantification of neurotransmitter amino acids by capillary electrophoresis laser-induced fluorescence detection in biological fluids 例： Anal Bioanal Chem (2010) 398:1973–1978 为什么要进行此项研究？ 1、对神经递质氨基酸进行测定有着重要的作用 神经递质氨基酸在生理机能上扮演着重要角色，例如谷氨酸和天冬氨酸都是兴奋性神经递质。对生物体中氨基酸含量的测定在生理学上有着重要的意义。 2、测定有难度、先前的方法存在缺陷 神经递质氨基酸在血浆、细胞等生物基质中都有分布，但由于含量低以及基质的复杂性使得其测定异常艰难。之前都是使用常规的方法进行测定，比如HPLC、酶反应及免疫组织化学等。但这些方法都需要很长的衍生化时间、产生过多的副产物、灵敏性较低且不能运用于大量的样品。