流式细胞仪使用方案.docx

流式细胞仪使用方案 一、单细胞悬液的制备 贴壁细胞↓ 0.25%胰蛋白酶消化 2 至 3min ↓ 移至玻璃离心管 ↓ 加入 D-hank‘s 液，轻轻吹打 ↓ 用 800-1000r/min 离心机离心 3 至 5min ↓ 『去上清，加入 PBS 均匀吹打，短时低速离心。』重复三次 ↓ 加 PBS 充分吹打，保证细胞数每毫升 1 万个作用 ↓ 加 95%乙醇（1：10），固定 30min ↓ 4 度冰箱过夜或-20 度长时保存 二、染色技术 1 选取荧光素 2 样品染色步骤 PBS 洗细胞 1-2 次 ↓ 加荧光单抗，暗处孵育 15-30min ↓ 如果必需，加荧光二抗，暗处孵育 15-30min ↓ PBS 洗细胞一次 ↓ 过 300 目尼龙网 ↓ 上机检测 3 对照的设置 阴性对照 同型对照（见附录） 三、流式细胞数据处理与分析 数据的显示通常可分为一维单参数直方图（histogramplot）、二维点图（dotplot）、二维 等高图（contour）和假三维图（pseudo3D）等。下面简述最常用的单参数直方图和二维 点图。 1. 单参数直方图单参数直方图是一维数据用得最多的图形，可用来进行定性分析和定量分 析。横坐标表示荧光信号或散射光信号强度的相对值，其单位用“道数”（channel）表示， 横坐标可以是线性的，也可以是对数的。纵坐标通常代表细胞出现的频率或相对细胞数。 下面以研究细胞周期为例说明如何分析单参数直方图所表达的信息。 单参数直方图 经 DNA 特异性染料（如 P1）染色的细胞群体，通过流式细胞仪测量区受激光照射后发出 特异性荧光，在一定条件下，荧光强度与细胞内的 DNA 含量成正比，DNA 含量高的细胞 发射的荧光强，反之则弱。 DNA 含量与细胞数目的关系，即 2N（2 倍体）代表 GO/G1 期细胞，4N（4 倍体）代表 G2/M 期细胞，两者中间代表 S 期细胞。这是典型的以 2 倍体和 4 倍体细胞为主的流式 DNA 图。通过上述信息可得到所测细胞群 中增殖细胞的数量。 2. 二维点图单参数直方图只能表明一个参数与细胞数量间的关系，不能显示两个独立参数 与细胞数量的关系。当需要研究两个或更多测量参数之间的关系时，可采用二维点图。 二维点图有两种形式，横坐标表示前向散射光（FSC），反映细胞的大小；纵坐标表示侧 向散射光，反映细胞内颗粒的大小和多少。坐标图上每一点同时表示具有相应坐标值的细 抱存在。 例如，人血白细胞悬液样品上机后，在坐标图上根据细胞大小和细胞内颗粒形态出现三类 不同颜色的细胞群，通过设门框把这三类细胞区分开，即红色显示淋巴细胞群（P1），绿 色显示单核细胞群（P2），蓝色显示中性粒细胞群（P3）。如果欲检测其中一种细胞两个 独立参数与细胞数量之间的关系，则选定其中一个门框。 假设选定淋巴细胞（P1），即可对其两种不同荧光素标记的细胞数量进行分析，出现第二 种形式的二维点图。横坐标为 PerCP-Cy5 荧光标记的 CD3 细胞数目（荧光道数），纵坐 标为 FITC 荧光标记的 CD4 细胞数目（荧光道数）。 因此，左上象限（Q1）代表 CD4―细胞百分比，右上象限（Q2）代表 CD4+/CD3-细胞百 分比，左下象限（Q3）代表 CD4―/CD3―细胞百分比，右下象限（Q4）代表 CD3―细胞 百分比。由此得知，在 CD3+淋巴细胞中 CD4―淋巴细胞所占的百分比。 双指标二维点囤的细胞群框定  荧光双染色二维点图 附： 一、流式抗体选购常识 由于在流式细胞实验过程中，荧光抗体对单细胞悬液的标记效果直接影响实验的数据质量。 因此，需要考虑各种影响流式抗体品质及检测效果的因素，例如抗体特异性、荧光素信号 强弱、荧光素标记方式、同型对照等。 流式抗体的选择： 流式抗体本身也是抗体，所以选择流式抗体一定要满足抗体选择最基本的条件：目标蛋 白特异性，反应种属以及应用实验。 流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。在流式实验过程中，尽量减少 实验工序和过程，以保证实验的真实和准确性。因此在条件允许的范围内，建议尽量用直 接标记的抗体进行实验而不去做间接标记。 流式抗体荧光标记的选择：如果实验中检测单一指标：不同荧光标记在不同的仪器上强 度不同。FACS Calibur 仪器为例：PE ＞APC＞PE-Cy5 ＞PerCP ＞FITC＞PerCP- Cy5.5，通常来说，PE 最强，适用于弱表达抗原。FITC 强度较弱，适用于强表达抗原， 使用范围比较广。用户需根据检测的目标蛋白进行具体选择。如果同时检测多个指标：确 认流式细胞仪能检测多少个通道：流式抗体每个通道只能选择 1 种荧光素。各个通道之间 的荧光素可以随意搭配。如：实验者同时检测三个指标，可以在图 1 中绿色、