MACS磁珠分选.doc-免疫磁珠荧光微球核酸提取磁珠彩色乳胶微球.doc

MACS磁珠分选 免疫磁珠法分离细胞原理 免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。 ? 磁性细胞标记方式 应用MACS技术进行磁性细胞分选最重要的一点是高质量的标记。要尽可能地增强阳性细胞的标记，并减弱背景染色。有两种基本的磁性标记方式：直接标记和间接标记。 ?1、直接磁性细胞标记（Direct magnetic cell labeling） ?（磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞）直接标记是最快速、最特异的磁性标记方法。目前有多种分选人、小鼠、大鼠以及非人类灵长类细胞的MACS直标微珠可供选用。 ?2、间接磁性细胞标记（Indirect magnetic cell labeling） （磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的细胞为所需细胞）?间接磁性细胞标记需要联合使用单克隆或者多克隆抗体和MACS间标微珠。未结合抗体、生物素化抗体或者荧光素标记抗体均可作为一抗标记细胞，再使用抗免疫球蛋白微珠、抗生物素或链霉亲和素微珠、抗荧光素微珠作为二抗磁性标记细胞。几乎针对任何种系任何细胞的任何一种单抗或多抗，均可用于间接标记。间接标记主要在如下情况时选用：当没有直标磁珠时；需要用几种抗体的混合物同时分选或去除多种类型的细胞；间接标记有放大作用，因此可在磁性分选抗原表达弱的目的细胞时使用；使用自备抗体或者配体的磁珠分选中。（一般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大，阳性分离法用行更多。） 　 二、MACS分选策略? 有两种基本的分选策略 阳性分选和去除分选。复合分选策略是将两种基本分选策略相结合或者联合使用多选微珠，从而实现细胞亚群的分选。 1、阳性分选策略（Positive selection strategy） 阳性分选中，目的细胞被磁性标记后，作为阳性标记组分直接分选出来。分选后的细胞不必去除MACS微珠，可立即用于培养或者后续操作。该方法可以将磁性标记的靶细胞富集10000倍。阳性分选策略优点：纯度高，回收率高，操作迅速、简便。 2、去除分选策略（Depletion strategy） 去除分选是把非目的细胞磁性标记后从细胞混合物中去除的方法，即未磁性标记的细胞为目的细胞。MACS分选柱技术加上强磁性标记可以去除高达4个对数级的细胞。去除分选策略适用范围：去除不需要的细胞；缺乏针对目的细胞的特异性抗体（如肿瘤细胞）；不需要抗体和目的细胞结合，即细胞不被激惹（如T细胞、B细胞、NK细胞功能分析）；复合分选的一部分。 3、复合分选策略 联合使用两种以上分选策略，主要用于细胞亚群的分选或者得到高纯度非常稀有的细胞。 （1）去除后再阳性分选（Depletion followed by positive selection） 细胞亚群的分选，可以先磁性标记非目的细胞，去除分选后对阴性组分再行磁性标记和阳性分选。适用范围：在细胞悬液中，非目的细胞也表达用来阳性选择目的细胞的抗原，就需要先去除这群非目的细胞；如果要分选非常稀有细胞，先从细胞悬液中去除非目的细胞，在富集细胞的基础上，进行阳性分选，可获得高纯度目的细胞。 （2）多重分选策略（MultiSort Strategy） MACS多重分选是一种根据多种表面标志磁性分选细胞的技术。多重分选中，首先用MACS多选微珠标记目的细胞，进行第一参数阳性分选。然后细胞与多选解离试剂共同孵育，后者可以将微珠从抗体上酶性解离下来。接着使用针对另一细胞表面标志的抗体－微珠复合物磁性标记阳性分选细胞。二次标记的细胞可以再次进行阳性分选或者去除分选。 三、磁分离细胞的重要指标 纯度和得率，这取决于磁珠所连接单抗的特异性和磁珠大小（磁性），然而太大的磁珠会影响细胞活性，也无法直接上流式。 四、目前市场上有2种磁性细胞分离系统 1、Small particles (≈50 nm) － MACS 2、Large particles (1200~4500 nm) －others（如Dynal） 五、小磁珠 1、优点 （1）对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养。 （2）可直接上流式检测，不影响散射光。 2、缺点 （1）需要很强的磁场来分离细胞。 （2）分离速度很慢，得率不高。 （3）一次性的分离柱，不能在普通试管进行。 （4）成本昂贵。 六、大磁珠 1、优点 （1）技术简单，分离可在试管中完成。 （2）易于增减细胞用量。 （3）速度快，得率高 （4）成本低 2、缺点 （1）对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于分离后培养。 （2）纯度低。 （3）容易阻塞FCM的喷嘴。