传代培养细胞的染色体标本的制备详解.ppt
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传代培养细胞染色体标本的制备 原 理 在细胞的生长周期中,中期染色体的长短、大小、恒定性正适合对其进行分析、研究。 因此利用人工的方法,使细胞分裂处于中期而不向后期转化,并收获细胞,经处理,制片后观察分析。 器材与试剂 培养箱、普通光学显微镜、离心机、水浴箱、天平等。 试管架、刻度离心管、滴管和滴头、酒精灯、冰载玻片等。 器材与试剂 Hela细胞 含10%小牛血清的高糖DMEM(。。RPMI1640) 秋水仙素(5微克/毫升) 0.075MKcl 固定液(甲醇/冰乙酸3:1) 乙酸优点:乙酸具有很强的穿透性能,甚至比甲醇的穿透性要高。能使核酸沉淀,阻止染色体收缩,使染色体结构免于破坏。经乙酸固定的物质,还能抵消甲醇的硬化作用。缺点:不能固定细胞质蛋白,并导致染色体片段的过分膨胀,故如要形成染色体的详细结构,必须把它与甲醇或类似的化学物质一道使用,后者能使组织收缩和硬化。 甲醇作用:迅速穿透组织,沉淀蛋白质,具有脱水性。蛋白质的不可逆转的变性,使组织硬化、脱水,固缩,能迅速进入细胞。 操 作 1、细胞培养 2、秋水仙素处理:加秋水仙素20ul( 5微克/毫升),混匀,37℃,6h。 3、收集细胞:胰酶消化细胞(方法同细胞传代---胰酶处理前用PBS洗一次),用培养液将细胞收集到离心管中,1500r/min离心,10min。 5、低渗处理:弃上清,加8ml(视细胞量多少而定) 0.075M KCl溶液,充分混匀(注意吹打不要过猛),置37℃水浴20min。 (KCl:使细胞和核膨胀,染色体松软,迅速分散。0.075M KCl:染色体轮廓清晰,可染性强,染色时间短,充分显示带型) 操 作 6、预固定 :低渗处理后,加0.5-1 ml固定液轻轻混匀,1500r/min离心,10min。(预固定可以固定染色体结构,并使细胞慢慢脱水,防止细胞离心破裂)。 7、固定 :弃上清,加8 ml(视细胞量多少而定)固定液,充分混匀,室温静置15min,1500r/min离心, 10min。 8、制备细胞悬液 :弃上清,视细胞数量多少加适量固定液制成细胞悬液。 9、制片 :取细胞悬液2-3滴,滴于冰玻片上,并迅速吹片,酒精灯火焰烤干。 10、烤片: 37℃,一周。 结 果 光镜100倍下人染色体G带照片 注意事项 胰酶消化细胞的时间一定要控制好 秋水仙素的浓度及处理时间很重要。 (或秋水仙酰胺) 低渗液的浓度与处理时间应掌握好。 固定液应临用时新鲜配制。
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