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生物制药技术工艺知识点总结题集

基因工程制药技术

基因工程制药的基本概念

基因工程制药是指将目的基因与载体分子组成重组DNA分子后，导入宿主细胞，通过微生物、动物细胞或植物细胞表达出目的蛋白，进而开发成药物的技术。它打破了物种之间的界限，能够生产出传统方法难以获得的药物，如胰岛素、生长激素、干扰素等。

基因工程制药的主要步骤

1.目的基因的获取

-从基因组文库中筛选：将生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶切割成一定长度的DNA片段，然后与载体连接，导入宿主细胞，构建成基因组文库。通过核酸杂交等方法从文库中筛选出含有目的基因的克隆。

-从cDNA文库中筛选：以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA，再将cDNA与载体连接，导入宿主细胞，构建成cDNA文库。由于cDNA文库只包含表达的基因序列，因此从中筛选目的基因更为方便。

-PCR扩增：如果已知目的基因的序列，可以设计特异性引物，通过聚合酶链式反应（PCR）从基因组DNA或cDNA中扩增出目的基因。PCR技术具有快速、灵敏、特异性强等优点，是目前获取目的基因的常用方法。

2.载体的选择与构建

-载体的种类：常用的载体有质粒、噬菌体、病毒等。质粒是一种环状双链DNA分子，能够在宿主细胞中自主复制，常用于基因克隆和表达。噬菌体是一类病毒，能够感染细菌，可用于构建基因组文库和筛选目的基因。病毒载体如腺病毒、逆转录病毒等，具有感染效率高、能够将外源基因整合到宿主细胞基因组中等优点，常用于基因治疗。

-载体的构建：载体的构建需要将目的基因与载体进行连接。常用的连接方法有粘性末端连接和平末端连接。粘性末端连接是指通过限制性内切酶切割目的基因和载体，产生互补的粘性末端，然后在DNA连接酶的作用下将它们连接起来。平末端连接是指通过化学合成或PCR扩增等方法获得平末端的目的基因和载体，然后在高浓度的DNA连接酶作用下将它们连接起来。

3.重组DNA分子的导入

-转化：将重组DNA分子导入原核细胞（如大肠杆菌）的过程称为转化。常用的转化方法有化学转化法和电击转化法。化学转化法是指将细菌细胞用氯化钙等化学试剂处理，使其处于感受态，然后将重组DNA分子加入到感受态细胞中，通过热休克等方法使重组DNA分子进入细胞。电击转化法是指将细菌细胞与重组DNA分子混合后，在电场的作用下使细胞膜产生瞬间穿孔，从而使重组DNA分子进入细胞。

-转染：将重组DNA分子导入真核细胞的过程称为转染。常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、电穿孔法等。磷酸钙共沉淀法是指将重组DNA分子与磷酸钙混合，形成沉淀，然后将沉淀加入到细胞培养液中，使细胞摄取沉淀中的重组DNA分子。脂质体转染法是指将重组DNA分子包裹在脂质体中，然后将脂质体与细胞混合，使脂质体与细胞膜融合，从而将重组DNA分子导入细胞。电穿孔法是指将细胞与重组DNA分子混合后，在电场的作用下使细胞膜产生瞬间穿孔，从而使重组DNA分子进入细胞。

4.重组体的筛选与鉴定

-抗生素筛选：如果载体中含有抗生素抗性基因，将转化或转染后的细胞接种到含有相应抗生素的培养基中，只有含有重组DNA分子的细胞才能生长，从而筛选出阳性克隆。

-核酸杂交筛选：将筛选出的阳性克隆进行培养，提取DNA或RNA，然后用放射性或非放射性标记的探针进行核酸杂交，检测是否含有目的基因。

-PCR鉴定：设计特异性引物，通过PCR扩增检测阳性克隆中是否含有目的基因。

-测序鉴定：对筛选出的阳性克隆进行测序，确定目的基因的序列是否正确。

5.目的蛋白的表达与纯化

-原核表达系统：常用的原核表达系统是大肠杆菌表达系统。大肠杆菌具有生长快、培养成本低、表达水平高等优点，但也存在不能进行蛋白质的糖基化等翻译后修饰、表达的蛋白质容易形成包涵体等缺点。为了提高目的蛋白的表达水平和质量，需要选择合适的表达载体和宿主菌，优化表达条件，如诱导剂的浓度、诱导时间等。

-真核表达系统：常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。酵母表达系统具有生长快、培养成本低、能够进行蛋白质的糖基化等翻译后修饰等优点，但糖基化方式与哺乳动物细胞有所不同。昆虫细胞表达系统具有表达水平高、能够进行复杂的蛋白质翻译后修饰等优点，但培养成本较高。哺乳动物细胞表达系统能够进行与天然蛋白质相同的翻译后修饰，表达的蛋白质具有较高的生物学活性，但培养成本高、生长缓慢。

-目的蛋白的纯化：目的蛋白的纯化是基因工程制药的关键步骤之一。常用的纯化方法有离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等。离子交换色谱是根据蛋白质的电荷性质进行分离的方法，凝胶过滤色谱是根据蛋白质的