3 分子病毒学讲义RNAi and Virology.ppt

思考题 什么是基因沉默(gene silencing)? 什么是siRNA、RNAi？举例说明RNAi在医学病毒学中有哪些应用？ RNA干扰在病毒学研究中的应用 2009.3.12 主要内容 RNAi的概念 发现 作用机制 特点 在医学病毒学领域的应用 RNA 干扰（RNA interference，RNAi） 定义 基因沉默(gene silencing) 指生物体特定基因由于种种原因不能表达。 RNA 干扰（RNA interference，RNAi） 定义 RNAi 由dsRNA介导的有特定酶参与的特异性基因沉默现象。 （RNAi is dsRNA-induced gene silencing.） RNAi主要属于转录后水平的基因沉默(PTGS) RNAi现象是生物普遍存在基因转录后沉默的一种方式，是RNA水平上调节基因表达的方式，是生物界古老而且进化上高度保守的现象之一； RNAi能高效特异的阻断基因的表达； 已经证实植物中的转录后基因沉默（PTGS）、共抑制（cosuppression）及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制（quelling）现象均属于RNAi在不同物种的表现形式。 在基因表达调控和基因功能研究中发挥重要作用，在药物靶基因的筛选、抗病毒、肿瘤基因治疗等领域有很好的发展前景。 RNAi的发现 90年代初，Rich Jorgensen的设想 ---发现“共抑制”现象(cosuppression) RNAi的发现 1992年， Romano和Macino等证明真菌也有类似现象 ---基因压制 (“quelling” in Neurospora crassa) 1995年，Su Guo和kemphues的秀丽线虫(C.elegans)实验 ---表明RNA干扰现象的存在 Discovery of RNAi RNAi的作用机制 RNAi的作用机制 RNAi 的特点 转录后水平的基因沉默(PTGS) 特异性高 高效性 需要ATP 可遗传性及远距离效应 RNAi的应用 基因功能的研究 疾病的治疗 cancer viral infection parasitic infection genetic disease RNAi在病毒学研究中的应用 研究基因的功能： 简单有效代替基因敲除(knockout)的遗传工具 “剔降”(knockdown) 防御病毒感染：研究发现，利用siRNAs可有效抑制病毒复制或阻止病毒的侵染，为进一步治疗病毒性疾病奠定了基础。 HIV、肝炎病毒、疱疹病毒、登革病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、HPV-16等。 存在的问题与展望 siRNA导入胞内的效率低； 21-23nt左右siRNA序列选择原则尚不清楚； 病毒逃逸使siRNA作用失效； RNAi 机制尚未完全阐明； * * 医学分子微生物学 基因沉默 基因沉默分为两种： 转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing, TGS) 指基因在细胞核内RNA合成受阻导致基因沉默 转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS) 指基因在细胞核内能稳定转录，在胞浆内却无相应的mRNA存在的现象。 × Rich Jorgensen：“cosuppression” 1998年，Andrew Z. Fire等明确了dsRNA介导的RNAi现象； 1999年，Hunter等印证了Fire等提出的RNAi现象是dsRNA引起的结论； dsRNA inject C. elegans Wt, Not stained Wt, Uninjected Wt+Antisense RNA Wt+dsRNA sense antisense Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridization 长链dsRNA在ATP参与下，被“Dicer”酶切割成20~25nt的 siRNA(small interfering RNA); ?“Dicer”酶：RNA酶Ⅲ家族核酸酶，依赖ATP核酸内切酶； ?Dicer作用底物：长度200～500nt左右的dsRNA； ?Dicer作用后的产物：dsRNA经切割后形成21～2