微生物菌种筛选与鉴定.ppt

综合对碳源、氮源及无机离子的优化试验，得到优化发酵培养基（二）： L-Glu 20g/L，CTA 9.864g/L，Glycerol 80.36g/L，(NH4)2SO4 7g/L，MgSO4?7H2O 0.5g/L，FeCl3?6H2O 0.0224g/L，K2HPO4 0.8922g/L，CaCl2 0.0323g/L， MnSO4?H2O 0.3g/L, 蒸馏水配置，用NaOH调pH6.5，0.1MPa灭菌20min。 基本发酵条件：采用300mL三角瓶装液量50mL，种子液24h，接种量4%（v/v）,摇瓶转速150r/min，37℃振荡培养96h。 摇瓶水平到反应器水平的优化配方 摇瓶、反应器培养基研究的两个层次 摇瓶——培养基设计的第一步 反应器—最终的优化的基础配方 例：青霉素发酵 发酵摇瓶：玉米浆4%，乳糖10%，(NH4)SO4 0.8% 轻质碳酸钙1% 发酵罐:葡萄糖流加控制总量10-15%，玉米浆总量4-8% 补加硫酸、前体等 摇瓶发酵培养基和罐的基础培养基差别很大 pH控制摇床：反应器水平上的摇瓶研究 * 小结：微生物菌种的发掘程序 微生物资源的全程开发大体要有：设计、收集样品、分离菌种、筛选、小试、中试、产业化等阶段。 即 方案→采样→筛选（初选→复选→终选） →实验室实验→中试→生产→产业化 总设计(开发目的、策略、工作基础、市场、投资风险 ↓ 采样(环境因素、天然及人工基质、微生物代谢类型等) ↓ 分离(富集、预处理、抑制剂、培养基设计、培养条件 ↓ 初筛（产生菌的培养、发酵、模型设计、目的产物或性状的测定等) ↓ 复筛 （目的产物或性状的复核、产生菌工艺性状的考察） ↓ 高产(高活性)产生菌(野生菌) ↓ 小型试验(最佳培养条件、生物学特性研究、菌种鉴定、工艺路线) 目的产物制备 目的性状、活性的测定 化学结构鉴定　(专利申请) ↓ 毒性(体外试验) ↓ 大量制备、小型应用实验(专利申请) ↓ 体内试验、药理研究 ↓ 临床试验 ↓ 中试（菌种改造、最佳工艺、临床实验、技术经济评价) ↓ 工业性试验（验证、修改、优化技术经济指标） ↓ 产业化 * 个人的几点体会 目的要明确：明确发掘目的并贯彻始终．是微生物资源开发最基本、时刻不离的原则。 创新为核心：新地方，新方法，新菌种，新模型，新产物。核心是不断革新．变换开发的策略。 模型是关键：建立准确、微量、快速、简便的筛选模型，尽早淘汰非目标菌株，加速筛选进程。 思路要大胆：敢为天下先 方法要得当：扎实的基本功 文献综述 * （4）生长圈法 工具菌： 营养缺陷型，不能合成的物质（生长因素）为目的菌积累的产物 菌落形态明显不同于目的菌 方法：106~107 工具菌与样品稀释液一起涂布至琼脂培养基表面，具有生长圈的菌落即为目的菌 适用：氨基酸，核苷酸，维生素产生菌的选育 （5）抑制圈 适用：抗生素产生菌的选育 工具菌：对目的抗生素敏感的微生物 例：目的菌为产生抗G+细菌的抗生素的菌株 工具菌可使用金黄色葡萄球菌 方法 目的菌分离：稀释分离法，培养长出菌落 代谢物积累：用打孔器（6MM）将菌落连同周围琼脂培养基一起取下，放一无菌空培养皿内，保湿培养4-5d，使新产生抗生素积累于小琼脂块中 测定：取107工具菌涂布于琼脂培养基，将小琼脂块放于上面培养过夜，抑菌圈的出现，说明琼脂块中有抗生素，大小说明抗生素单位的高低 琼脂块培养法筛选抗生素产生菌程序 （6）菌落特征 从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。 * （7）从产物角度出发 在培养时以产物的形成有目的的设计培养基 利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素 产物分子的结构定性分析（利用紫外扫描光谱、核磁共振、CD谱、高压液相色谱、远红外分析、X-射线衍射分析、穆斯堡尔谱等） 产物的定量分析 3、厌氧性微生物的分离法 （1）去除培养基中的溶解氧，降低Eh（氧化还原电位） 煮沸法：将培养基置沸水中煮沸15分钟，驱除其中的溶解氧，勿再摇动，Eh可降至0.1V 以下 培养基预还原：将培养基中加入还原性物质：半胱氨酸，巯基化生物，Na2S，抗坏血酸等降低Eh （2）创造无氧环境 物理除氧 空气置换法：干燥器或厌氧培养罐 抽真空 76mmHg→充入N2 （反复3次）→充入CO2 10% +H2 10% + N2 80% 化学除氧 H2 + O2 → H2O (钯作催化剂） GASPAK罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氢钠化学反应产生H2 和CO2，H2与O2反应生成水 厌氧指示剂 （3）厌氧分离（培养）技术 高层琼脂柱技术