氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量磷.doc
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氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量磷
一、采样与样品预处理(同微生物生物量碳)
土壤样品的采集方法和要求与测定其它土壤性质时没有本质区别。采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和可见的土壤动物(如蚯蚓)等,然后迅速过筛(2~3 mm),或放在低温下(2~4℃)保存。如果土壤太湿无法过筛,进行晾干时,必须经常翻动土壤,避免局部风干导致微生物死亡。过筛的土壤样品调节到田间持水量的50%左右,在室温下于密闭装置中预培养1周,密闭容器中要放入两个50mL的烧杯,分别加入水和稀NaOH,以保持其湿度和吸收释放的CO2。预培养后的土壤最好立即分析,若需要放置一段时间,在低温下(2~4℃)最好不要超过10d。
二、方法—氯仿薰蒸浸提法(FE)
1、方法原理
土壤经氯仿薰蒸处理,微生物被杀死,细胞破裂后,细胞内容物释放到土壤中,导致土壤中的可提取的磷大幅度增加。通过测定浸提液中磷的增加量,估算土壤微生物量磷。浸提液中磷用钼锑抗比色法测定。
2、仪器及设备
培养箱;真空干燥器;真空泵;往复式振荡机(速率200rev/min);冰柜;分光光度计
3、试剂
无乙醇氯仿:量取500 mL 氯仿于1000 mL的分液漏斗中,加入50mL硫酸溶液[?(H2SO4)=5%],充分摇匀,弃除上层硫酸溶液,如此进行3次。再加入50 mL去离子水,同上摇匀,弃去上部的水分,如此进行5次。得到纯氯仿存放在棕色瓶中,并加入约20g无水K2CO3,在冰箱的冷藏室中保存备用。(试剂浓硫酸 ?(H2SO4)=95~98%
0.5mol/L NaHCO3:42.0g NaHCO3(化学纯)溶于800mL水中,用0.5mol/L NaOH调节溶液的pH至8.5,用去离子水稀释至1L。溶液贮存于塑料瓶中。长时间放置,使用前必须检验pH值。
钼锑抗试剂:称取酒石酸锑钾0.5g,溶解于100mL水中,制成0.5%的溶液。另称取钼酸铵10g,溶于450mL水中,徐徐加入153mL浓H2SO4,边加边搅。再将0.5%的酒石酸锑钾溶液加入到钼酸铵溶液中,最后加水至1
临用前(当天),称取左旋抗坏血酸1.5克(Vc,三级),溶解于100mL钼锑贮备液中,
磷标准溶液:准确称取在105℃烘箱中烘干的KH2PO4(分析纯)0.4394g,溶解在400mL水中,加浓H2SO45mL(防止发霉),转入1L容量瓶中,定容,摇匀。此溶液为
吸取磷标准溶液5mL,稀释至100mL,即为5mg/L P标准溶液(不宜久存)。
250ug/mL KH2PO4:0.5492 g KH2PO4-定容至 500ml 水;0.10984 g定容至100 m
硫酸溶液(2.5 mol L-1):量取70.0 ml分析纯浓硫酸,稀释至500 ml。
1mol L-1 NaOH:称取40 g分析纯氢氧化钠,溶于1
2,6 二硝基酚指示剂:称取0.2 g
4、操作步骤
4.1薰蒸
称取相当于5.0g烘干土重的湿润土壤3份,分别放在约100 mL的烧杯中,一起放入同一干燥器中,干燥器底部放置小烧杯盛装少量的水以保持湿度,同时放入一个装有50mL NaOH溶液和一个装有约50mL的无乙醇氯仿的小烧杯(根据干燥器的大小可以增加氯仿的用量,同时加入少量的直径约为0.5mm的碎瓷片),用少量凡士林密封干燥器,用真空泵抽气至氯仿沸腾并保持至少2 min。关闭干燥器的阀门,在25oC的黑暗条件下放置24
打开阀门,如果没有空气流动的声音,表示干燥器漏气,应重新称样进行薰蒸处理。当干燥器不漏气时,取出装有水、碱液和氯仿的烧杯,氯仿倒回瓶中可重复使用。擦尽干燥器底部,用真空泵反复抽气,每一次都要打开干燥器,以加快除去氯仿的速度,直到土壤闻不到氯仿气味为止。
薰蒸开始的同时,称取等量土壤3份,用NaHCO3 溶液(见下一步骤,试剂2)浸提,同时做不加土壤为空白对照。浸提液在室温下可以放置1周,4℃下放置1个月或在-15oC
4.2浸提
薰蒸结束后,将土壤全部转移到250 mL的震荡瓶中,加入80 mL0.5mol/L NaHCO3溶液,在振荡机上振荡浸提30min(25℃,185rev/min),用无磷滤纸
薰蒸开始的同时,称取等量土壤3份,同上用0.5mol/L NaHCO3 80 mL溶液浸提,同时做不加土壤为空白对照。浸提液立即测定或在-15oC下保存。
P回收率测定
另取等量土壤3份,加入0.5 mL 250ug/mL KH2PO4(50ugP/g土), 同上加入80 mL 0.5mol/L NaHCO3溶液浸提,浸提液在室温下可以放置1周,4℃下放置1个月或在-15oC
4.3测定
吸取土壤浸提液25 mL(根据土壤含磷量进行调整)于50mL容量瓶中.
调解pH:加2,6-二硝基苯酚1-2滴,用3mo
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