抗性淀粉及总淀粉测定方法.doc

抗性淀粉及总淀粉测定方法 采用Megazyme抗性淀粉试剂盒法，测定方法见试剂盒说明书（下附） 原理（AOAC法 2002.02 ;AACC法32-40） 抗性淀粉的测定方法： 样品使用α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶 总淀粉测定方法：即抗性淀粉与非抗性淀粉总和。 抗性淀粉检测试剂盒 K-RSTAR （100次分析） 应用性和精确性 这个方法需要样品中RS含量多于2% w/w。如RS含量多于2% w/w，常规标准误差为±5%。少于2% w/w RS的误差更高。 试剂盒 瓶子1：淀粉葡糖苷酶麦芽糖苷 瓶子2：α-胰淀粉酶(胰酶，10g，3Ceralpha U/mg)。4℃下稳定性 3年。 瓶子3：GOPOD 试剂缓冲液。磷酸钾缓冲液（1M，pH7.4），对羟基苯甲酸（0.22M）和叠氮化钠（0.4%W/V）。4℃下稳定性 3年。 瓶子4：GOPOD试剂酶。葡糖氧化酶（12,000U）加上过氧化物酶（650U）和4-氨基安替比林 瓶子5：D-葡萄糖标准溶液（5 mL,1.0mg/mL）溶于苯甲酸0.2%（w/v）。室温下稳定性5年。 瓶子6：抗性淀粉对照。抗性淀粉含量如表所示。室温下稳定性5年。 溶液/悬浮液的制备 1.使用瓶子1中提供的的产品（AMG；溶液1）。这个溶液是有粘性的，因此应使用正向移液器移取分装。4℃下稳定性 3年。 稀释AMG（300 U/ mL） 用前制备 2.用100mL顺丁烯二酸钠缓冲液(100mM，pH6.0；试剂1，非提供)悬浮1g瓶子2中的产品(α-胰淀粉酶)，搅拌5分钟。加入1.0mL稀释的AMG（300 U/ mL） 3.用蒸馏水稀释瓶子3中的产品（GOPOD 试剂缓冲液）稀释至1L，这就是制备的溶液3。制备后马上使用。 备注： （1）如果浓缩缓冲液在-20℃下储存，它将形成结晶盐，因此必须要完全溶解才可以用蒸馏水稀释。 （2）这个缓冲液包含0.4%（w/v）的叠氮化钠。因此这是个有毒化学物，应进行相应的处理。 4.取瓶3中制备好的溶液320mL溶解瓶子4里全部的产品，定量转移这个溶液至装有剩余溶液3的瓶子中。用铝箔封盖瓶子以遮光。这就是葡萄糖测定试剂（GOPOD 试剂），可以在2-5℃保存3个月或者-20℃下保存一年。 如果试剂要以冷冻态储存，应分装后再冻存。 当试剂是新鲜制备的，它的颜色应是浅黄色或浅粉色。在4℃储存2-3个月时会演变成深粉色。当以蒸馏水为对照时，这个溶液的吸光度应小于0.05。 56.使用瓶子5或6提供的产品。室温下稳定性5年。 没有提供的试剂（应购买分析纯级） 1.顺丁烯二酸钠（马来酸钠）缓冲液(100mM，pH6.0)加上5mM二水氯化钙和叠氮化钠（0.02%w/v）. 用1600mL蒸馏水溶解23.2g顺丁烯二酸，用4M（160g/L）氢氧化钠调节pH至6.0，加入0.74g二水氯化钙和0.4g叠氮化钠，并溶解。定容至2L。4℃下可保存一年。 2.醋酸钠缓冲液（1.2M，PH3.8） 将69.6mL的冰醋酸（1.05g/mL）加至800 mL的蒸馏水中，用4M氢氧化钠调节pH至pH3.8。用蒸馏水定容至1L，室温下可保存一年。 3.醋酸钠缓冲液（100mM，PH4.5） 将5.8mL的冰醋酸加至900 mL的蒸馏水中，用4M氢氧化钠调节pH至4.5。用蒸馏水定容至1L，4℃保存2个月。 4.氢氧化钾溶液（2M） 将112.2gKOH加至900 mL的去离子水中，搅拌溶解。定容至1L，密封保存。室温下可保存2年。 5.含水乙醇（或者IMS）（大约50%v/v） 将500mL乙醇（95%v/v或者99%v/v）或者工业甲基化酒精（IMS；变性乙醇；95% v/v 乙醇加上5%甲醇）至500mL的水中。密封保存，室温下稳定保存2年。 备注： 一系列包含RS的对照样品0.6%-78%w/w可从Megazyme公司购买。 设备（推荐） 1. 离心式粉碎机，带有齿轮转子和1.0mm筛子，或类似的装置。小型样品可选择旋风磨碎机替代。 2.绞肉机-手动或电动的，装有4.5mm筛。 3.台式离心机-能够放入16×120mm玻璃试管，速度大约1500g(3000rpm) 4.振荡水浴器，可设定为每分钟100次直线运动（振荡速度为每分钟200里程），振荡距离35mm,37℃。 5.水浴锅-能够保持在50+0.1℃。 6.涡旋混匀器。 7.磁力搅拌器。 8.磁力搅拌棒-5×15mm。 9.pH计 10.计时器 11.分析天平（精确到0.1毫克） 12.分光光度计-能够设定510nm（10mm路径长度） 13.100μL移液器及一次性枪头 14.连续分配器 15.培养管-螺旋帽，16×125mm 16.玻璃试管-16×100mm，14mL容量 17.塑料盒，可放置试管架，也可作为冰