乳腺癌MCF-7细胞对5-氟尿嘧啶敏感性探究.doc

乳腺癌MCF-7细胞对5-氟尿嘧啶敏感性探究【中图分类号】R737【文献标识码】A【文章编号】1672-3783（2010）12-0157-02 作者简介：王炜（1981-），女，硕士研究生，从事激光共聚焦显微镜和流式细胞仪在医学和生物研究方面的应用的研究。 【摘要】目的：探讨不同浓度5-氟尿嘧啶（5-Fu）对乳腺癌细胞凋亡率的影响，以期为临床用药提供参考。方法：采用MTT法，流式细胞术，形态学观察等方法，检测5-氟尿嘧啶诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡与时间、剂量的关系，以及对细胞周期的影响。结果：细胞凋亡率随5-Fu剂量的增加而显著增加，当5-Fu浓度超过100μmol/L时，细胞凋亡率增加趋缓慢, 流式细胞仪检测细胞周期，结果显示5-Fu处理后MCF-7细胞G1期比例增加，发生G1/S期阻滞。结论：(1)5－Fu体外诱导乳腺癌MCF-7 细胞凋亡具有对剂量和时间依赖的特点；（2）5-Fu剂量过大，诱导乳腺癌细胞凋亡的同时也可能诱导细胞坏死；（3）5-Fu引起的G1/S期细胞周期阻滞作用可能是5-Fu杀伤乳腺癌细胞的机制之一。 【关键词】5-氟尿嘧啶（5-Fu）；乳腺癌；凋亡 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近年来我国乳腺癌发病率死亡率呈持续上升的趋势。在现代乳腺癌临床治疗中，化疗起到重要作用。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)是临床常用抗肿瘤代谢药物，由于其具有快速、高效和低毒副作用的特征，目前已成为临床治疗恶性肿瘤如胃肠道癌、乳腺癌、肝癌等首选的化疗药物，但其对心脏和神经系统具有明显的毒副作用[1]。因此，在临床上为了能达到好的疗效又最大限度的减少化疗药物的毒副作用，需对药物的使用剂量进行筛选。本实验采用MTT法，流式细胞术，形态学观察等方法，观察5-氟尿嘧啶诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡与时间、剂量的关系，为临床用药提供指导。 1 材料与方法 1.1 乳腺癌细胞株培养和药物处理:在含10％小牛血清的RPMI 1640培养液中，37℃、5％CO2培养箱中培养。细胞融合率达到80%-90%时，换用浓度为1、 10、 100、 1000 μmol/L的5-Fu分别作用24h，48h后收集细胞用于后续实验。 1.2 主要试剂与仪器:MCF-7购自中科院上海细胞生物所细胞库，培养液RPMI一1640（sigma公司），小牛血清（杭州四季青生物工程公司），5-Fu（江苏南通精华制药有限公司），噻唑蓝(MTT)(sigma公司)，碘化丙啶(PI) （Sigma 公司）。LEICA TCS SP5 流式细胞仪（德国 LEICA公司），Forma 3111水套式CO?2细胞培养箱（美国Forma公司）。 1.3 研究方法 1.3.1 MTT法测定细胞对5-Fu敏感性, 参考文献[2]。 1.3.2 激光扫描共聚焦显微镜下细胞形态的观察:细胞接种于载玻片上，用5-F u处理24 h后。取出载玻片用PBS漂洗2遍，细胞涂片凉干后纯丙酮固定，90％甘油封片处理后，用激光扫描共聚焦显微镜观察并拍照记录用药组和对照组细胞的形态变化。 1.3.3 流式细胞术检测5-Fu处理下细胞凋亡情况:将5-Fu处理后的贴壁细胞用胰酶消化，制成单细胞悬液，用75%乙醇于-20℃固定12小时，1000r/min离心收集细胞，按照细胞凋亡检测试剂盒说明操作后，用流式细胞分析仪检测，软件分析细胞凋亡率。 1.3.4 流式细胞数检测5-Fu对细胞周期的影响:将5-Fu处理后的胞贴壁细胞用胰酶消化，制成单细胞悬液，用75%乙醇于-20℃固定12小时。以1000r/min离心收集细胞， 按照细胞周期检测试剂盒说明操作后，用流式细胞分析仪检测，软件分析细胞周期。 1.4 统计分析:采用 SPSS 17.0软件, 显著性比较采用t检验。 2 结果 2.1 MTT法检测结果表明，5-Fu在体外可明显抑制MCF-7细胞的增殖，当浓度100μmol／L 抑制作用更为明显，且呈现明显的对剂量和时间依赖的特点(表1) 表1 5-Fu对乳腺癌MCF-7细胞的增殖影响(P0.05) 组别 细胞增殖抑制率 24h48h 1μmol/L 10．2%±1.2 21．8%±0.8 10μmol/L 18．9%±0.6 42．9%±2.5 100μmol/L 32．8%±2.1 62．9%±3.3 1000μmol/L 67．5%±4.3 79．9%±3.4 2.2.4 细胞形态的观察:不同浓度5-Fu处理48h后，各孔均见有贴壁细胞，但随着5-Fu作用时间的延长，贴壁细胞的数量减少，悬浮细胞明显增多，细胞生长明显减缓，细胞皱缩，与周围的细胞