激光共聚焦成像系统.ppt.PPT

培养的人肝癌细胞吖叮橙染色 高清晰成像 2、半定量荧光强度分析 荧光信号通过光电倍增管转化为电信号，经过电脑分析可对荧光信号进行相对定量测定。 随机圈取细胞 可得到所圈细胞的相对荧光强度值 利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。 3、荧光标记表达量测定 4、分层扫描（切片扫描） 按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小，可控制样品扫描层面的厚度。即样品中相当薄的一层被探测到，而其他层面不影响成像。 当观测较厚样品时，普通透射光不能透过样品，则可以通过切片扫描检测荧光的方法来观测。 较厚层面 较薄层面 人血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。 4、分层扫描（切片扫描） 连续分层扫描，可得到CT片类似的效果，对样品Z轴的结构进行分析。经计算机数据重组，可观测空间结构，空间定位，三维重组。 4、分层扫描（切片扫描） 5、多色荧光标记检测 普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描，多通道同时探测。 绿色：SYBR 14染色，活精子 红色：PI染色，死精子 肺动脉内皮细胞 蓝色：Hoechst 33342 ，染DNA 红色：PI，染核仁RNA 绿色：Alexa Fluor 488染肌丝蛋白 高速双转盘活细胞共聚焦成像系统? 型号：UltraView VoX （PerkinElmer） 放置地点：401-1310 管理员：封琼 收费：200元/小时 物镜： 10X，20X，40X，60X (oil) ，100X (oil) 激光器： 405nm， 440nm， 488nm， 514nm， 561nm， 640nm 载物台式活细胞培养装置：恒温、恒湿、5%CO2 活细胞长时间观察：硬件防漂系统 图像分析平台：三维立体观测，三维定量分析 高速双转盘活细胞共聚焦成像系统? 速度更快 灵敏度更高 光毒性更低 实现活细胞3D~6D（XYZTWP）实时成像 高速双转盘活细胞共聚焦成像系统? 可实现多种荧光染料标记的活细胞和固定细胞/组织的共聚焦成像。 能够对活细胞或活体组织实施低光漂白、低光毒性的连续扫描，有助于长时间维持细胞的活性,适于观察细胞周期、细胞骨架动态等长时间或极度光敏感过程。 能够在高分辨率和高灵敏度的情形下，观察快速的生物过程，如蛋白质的细胞膜输运和钙释放/钙闪过程。 能够完成三维、多荧光通道、多位点、长时程平行检测，适于复杂实验的多维图像采集【空间三维（xyz）、时间（t）、波长（w）、位置（p）】。 高速双转盘活细胞共聚焦成像系统? 常用荧光探针介绍 细胞活性探针 细胞器探针 细胞骨架探针 核酸探针 细胞内离子探针 细胞活性探针 活细胞探针：吖叮橙（AO） 是一种离子泵活性指示剂，弱碱性，在动物细胞溶酶体、植物液泡和含胰岛素的分泌小粒等酸性细胞器中浓集。 死细胞探针：碘化丙锭（PI） 膜不透性DNA探针，细胞膜破损后与DNA结合 细胞器探针 线粒体探针：罗丹明123（Rhodamine123），能渗入细胞，带阳离子的荧光探针，不染色内质网。 溶酶体探针：中性红（Neutral Red） 内质网探针：DiOC6属于短链碳酸花青苷染料。可标记活细胞内质网，也可用于甲醛固定的细胞内质网。 细胞骨架探针 F-肌动蛋白荧光探针： 鬼笔环肽：特异性地与F-肌动蛋白荧光探针结合，纳摩尔浓度下也可标记 核酸探针 吖叮橙（AO） 与DNA结合，发射波长525nm，显绿色与RNA结合，发射波长650nm，显红色 Hoechst 与DNA结合，分辨率高 DAPI 与双链DNA结合荧光增强20倍，与单链DNA结合无荧光增强。荧光强度比Hoechst低，光稳定性强于Hoechst。 1 ??荧光光源——般采用超高压汞灯(50一200W）或者高功率LED光源，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。滤片系统是荧光显微镜的重要组成部分，由激发滤片、二向色性滤光片、发射滤片组成。激发滤片位于光源和标本之间，允许特定波长范围的光通过