第四章基因检测相关地实验.doc

第四章　基因检测相关的实验人类基因组计划的完成以及后基因组学研究的不断深入，标志着现代医学的发展已逐步进入“基因组医学”的时代。疾病分子机制的研究也将为包括疾病的分子诊断、分子治疗在内容的“分子医学”的发展提供动力。其中分子诊断技术已在许多临床领域得到运用，这必将为二十一世纪人类医疗保健带来福音。因此，从分子水平上了解医学遗传学相关的实验技术对于现代医学教育与医学实践具有十分重要的意义。实验4-1 人基因组DNA的提取一、实验目的掌握人外周血基因组DNA的抽提方法。二、实验原理从不同组织细胞或血细胞中提取高质量的DNA是进行基因诊断的先决条件。制备高质量DNA的原则是：①将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净；②尽可能保持DNA分子的完整。在提取DNA的反应体系中，蛋白酶K为广谱蛋白酶，其主要特征是能在SDS和EDTA存在的情况下保持很高的活性，可将蛋白质降解成小的多肽和氨基酸。SDS是离子型表面活性剂，主要作用是：①破坏细胞膜及核膜；②解聚细胞中的核蛋白；③与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来；④抑制DNA酶活性，使DNA分子尽量完整地分离出来。三、实验用品和材料（一）试剂 1．抗凝剂：EDTA 2%（W／V）生理盐水抗凝剂。称取2g EDTANa2、0．85g NaC1，加双蒸水至100m1。1ml该试剂可抗10ml全血凝结；亦可用医用人ACD抗凝剂抗凝。肝素能抑制限制性内切酶活性，因此一般不用肝素抗凝。 2．15mmo1／L Tris-HCl（pH8.0），15 mmo1／L EDTA（pH8.0），15 mmo1／L NaCl （简称TES溶液）；用lmo1／L Tris-HCl（pH8.0），0.5 mmo1／L EDTA（pH8.0），3mo1／L NaCl稀释成15 mmo1／L TES溶液。 3．10%（W／V）SDS。 4．15mmo1／L TES饱和酚，重蒸酚在热水浴（100℃）中溶化后加入1/3体积的15 mmo1／L TES溶液，充分混匀后，放冰箱中静置6h以上。酚层在下，水层在上。吸掉上层多余的TES溶液，冰箱中避光保存备用。为防止酚被氧化成酮，可加少量8-羟基喹啉（2 mmo1／L～5mmo1／L）。 5．氯仿／异戊醇（24：1，V/V），现配现用。 6．蛋白酶K。 7．10mmo1／L Tris-HCl，1mmo1／L EDTA（pH7.5）（简称TE溶液）。用1mo1／L Tris-HCl（pH7．5），0．5mo1／L EDTA（pH 7．5～8．0）稀释配制。（二）用品：Eppendorf试管、离心管、吸管、加样器、枪头、离心机、水浴箱、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽。四、实验方法和步骤1．白细胞的分离 （1）抗凝血用1～2倍的生理盐水或磷酸缓冲的生理盐水（PBS）稀释并混合。 （2）在50ml离心管中加入1倍体积淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），在上面仔细铺一层2倍体积已稀释的血液。 （3）室温以2000rpm离心15min～20min，红细胞应沉于管底，而白色的淋巴细胞应分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面。 （4）吸弃血浆，小心吸取淋巴细胞层，直至把淋巴细胞转移完全。 （5）用生理盐水或PBS洗淋巴细胞二次。 （6）最后得到的淋巴细胞沉淀，可立即用于DNA的提取，或冻存于超低温冰箱中，直至使用。2．DNA的提取（1）在5 m1 15mo1／L TES中悬浮白细胞，加蛋白酶K 250μg～350μg（50μg/ m1～70μg/ m1），10%SDS至终浓度0.5%（加260μl左右）。（2）充分混匀，放50℃水浴中保温3h～5h，其间振摇2～3次。（3）冷却至4℃，加等体积15 mo1／L TES饱和酚。（4）轻轻振摇，使水相和酚层充分混匀。（5）4℃5000rpm～8000rpm离心15min～20min。此时DNA溶液在上层，酚位于下层，中间是变性蛋白层。（6）用吸管小心吸取上层粘稠溶液，移至另一离心管。注意尽量不要带出中间蛋白层。（7）DNA溶液再加等体积15 mo1／L TES饱和酚抽提一次，按（5）、（6）离心并吸至另一离心管。（8）加等体积氯仿/异戊醇按步骤（4、5）抽提，离心5min。（9）吸出DNA溶液后，再步骤（8）抽提一次。（10）用吸管将DNA溶液移至Eppendorf中，冰浴至0℃。（11）加2.5倍体积95%冷乙醇震摇，可见DNA白色沉淀析出。（12）用75%冷乙醇清洗3～4次。（13）室温干燥或冷冻干燥DNA。（14）加适量TE溶液溶解DNA。 3．DNA的鉴定及定量 （1）比色法：取DNA溶液20μl，用蒸馏水稀释至400μl。以蒸馏水做空白，在紫外分光光度计上测定O