SOD酶活力测定实验.doc

摘要：通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。跟踪提纯过程活性的分布，并评价提取过程各步骤的效率。实验结果证实随着不断的分离提纯，总活力以及总蛋白不断减小，比活力不断上升，最终得到的结果为总纯化倍数为0.68，活性得率为5.24%。 前言： 超氧化物歧化酶简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶。分布很广，几乎从哺乳动物到细菌，以及植物中均存在。在微生物中主存于需氧菌。SOD是催化超氧阴离子（O2-）歧化反应的酶类，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2.H2O2 由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O 和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。它的存在与生物体内的解毒作用有关，也发现与机体的衰老、肿瘤及免疫性疾病等有关。 自1968 年发现SOD 后，立刻引起科学界的高度重视，近40 年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD 也有了产品.国外从牛红细胞中制得的超氧化物歧化酶，其商品名为Orgotein.不少人研究Orgotein的药理性质，证明它无毒，无抗原性，能抗发炎、抗超氧离子、抗病毒感染。二十世纪80 年代后期，我国关于SOD 的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。SOD作为治因而受到医药界的关注。目前中国国内已进入临床试验阶段。 本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。 实验材料与方法： 一材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用. 二试剂:葡聚糖（sephadexG-100）, NaCl（AP）, 磷酸氢二钠（AP）, 磷酸二氢钠（AP）, 三羟甲基氨基甲烷（Tris）, 盐酸（浓盐酸），硫酸铵（AP）, PEG6000 ， 考马斯亮蓝G250 , 磷酸 ，乙醇（95%） ， 牛血清蛋白BSA , 连苯三酚(焦性没食子酸), EDTA(钠盐) , 超氧化物歧化酶（sigma公司）。 三仪器:离心机，紫外分光光度计，柱层析装置，玻璃层析柱，匀浆机，各型号烧杯、试管、量筒，带毛塞试管，漏斗，移液枪， 移液管，玻璃棒，电子天平等。 四实验方法和步骤： 称25g绿豆,洗涤，蒸馏水浸泡过夜，加入250 ml pH7 0.05 mol/L pb液，匀浆机匀浆，两层纱布过滤，离心（3000 rpm）得清液，取少量清液作为样1进行SOD活性测量，计算材料中SOD总活性单位及比活性单位（units/mg Pr）。 所得清液测量总体积，缓慢加入硫酸铵至35％饱和度，浓度为19.4g/100ml，4℃冰箱静置分层。 离心（3000rpm） 取清液，取少量为样②，测量SOD活性、蛋白质含量测量，计算SOD总活性单位及活性单位。 步骤3中的清液缓慢加入硫酸铵至65%饱和度（过程充分搅拌），5℃至分层，离心（3000rpm） 取沉淀，取样③，计算SOD总活性单位及活性单位。 准备透析袋：透析袋事先预处理，Na2CO3 10g/L, EDTA 1 mmol/L 煮沸30分钟，蒸馏水洗涤，并浸泡于5℃中备用。 所得清液测量其部体积，缓慢加入硫酸铵至65%饱和度（18.4g/100ml）（过程充分搅拌），5℃ 静置至分层澄清，离心除去清液，得沉淀。沉淀溶于水并定容到一定体积，装入透析袋，于蒸溜水中透析过夜。透析后溶液用滤纸过滤得清液。重新装入透析袋中用PEG6000包埋进行浓缩。 装柱：先向柱内加满洗脱剂，检查是否漏水；再打开出液口，排出里面的气泡，特别是要排除床底支持物上的气泡。关闭出液口，使柱中洗脱剂的体积约占总柱体积的15％。 调节有利于装柱的凝胶浆稀稠度，适当稀释有利于装柱过程中气泡的排除。但稀释度太高则一次装柱的高度不够。将一根直径稍小的玻璃棒插入层析柱底部，沿玻璃棒将胶浆徐徐注人柱内，一边灌胶，一边提起玻棒。注意避免产生气泡。柱要一次装完。柱装好后，停10min，然后打开出液口，排出过量洗脱剂。柱内胶面上部保留2～3cm洗脱剂。再将恒压洗脱剂瓶与柱上端相连。流过至少2倍住体积的洗脱剂之后，流速开始稳定下来（层析柱平衡过程,1ml/min,1.5h）。调节恒压洗脱剂瓶的高低位置，得到理想流速。（1ml/min） 加样：上述浓缩液过滤后得清液加样，要尽量快速、均匀。一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％～5％(质量分数)左右.（这里用5%）。加样应加于柱中心，避免沿柱壁加入。 洗脱：恒压重力洗脱。这里采用1ml/min