类弹蛋白的分子设计、非色谱纯化及分子动力学模拟硕士学位.doc

硕士学位论文 类弹性蛋白的分子设计、非色谱纯化及分子动力学模拟  原创性声明 本人声明兹呈交的学位论文是本人在导师指导下完成的研究成果。论文写作中不包含其他人已经发表或撰写过的研究内容，如参考他人或集体的科研成果，均在论文中以明确的方式说明。本人依法享有和承担由此论文所产生的权利和责任。 学位论文作者签名： 日期： 学位论文版权使用授权声明 本人同意授权华侨大学有权保留并向国家机关或机构送交学位论文和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅。 论文作者签名： 指导教师签名： 签 名 日 期： 签 名 日 期： Dissertation Submitted to the Academic Degree Committee of Hua Qiao University Molecular design, non-chromatographic purification and dynamics simulations of elastin-like peptides By Kaizong Huang In Candidacy for the Master’s Degree of Biochemistry and Molecular Biology Supervised by Assistant Professor Guang-ya Zhang Hua Qiao University November 2011 摘要 类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptides，ELPs)，是一种非常重要的具有弹性功能的，且对环境温度有很大敏感性的生物高分子，利用类弹性蛋白的可逆相变特性，使其在蛋白纯化、作为药物载体、组织工程等方面得到广泛的应用。 ELPs的相变温度是定量描述其相变温度性质最便利的参数，通过相变温度实测值探讨与其序列组成、每一单体的Xaa数量、浓度等因素间的关系具有重要意义。将伪氨基酸组成中的的相关系数部分作为类弹性蛋白的特征向量，从类弹性蛋白序列出发，利用最小中位方差回归，找出其序列相关系数的最佳阶数。运用均匀设计分别对支持向量机与BP神经网络参数进行优化，并进行交叉验证，结果表明BP神经网络获得的预测模型最佳，其绝对误差为0.39℃，均方根误差为0.89℃. 从头设计了类弹性蛋白多肽的序列并人工合成其编码基因片段，克隆至改造后的表达载体pET-22b中，构建重组表达载体，转化于大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达，采用可逆相变循环经高速离心对其进行纯化，利用SDS与色氨酸标准曲线对ELPs进行分析与定量，并考察了五种阴离子与三种阳离子及浓度对类弹性蛋白相变温度的影响。结果表明：0.4 mM的Na2CO3 能使25μM ELP[KV8F-20]相变温度降低至19℃，此ELPs序列有望开发成一新型纯化标签，为今后重组蛋白的非色谱分离纯化奠定基础。 通过分子动力学模拟探讨类弹性蛋白ELPs发生可逆相变 (ITT， inverse temperature transition)的分子机理及预测ELP[KV8F-20]的相变温度。随着温度的升高，类弹性蛋白经历可逆相变，由舒展的构象过渡到折叠构象。在300K~400k间5个不同的温度下，对ELP[KV8F-20]在水溶液与1M的NaCl溶液各进行9ns的模拟。模拟过程中，ELP[KV8F-20] 在水溶液与1M的NaCl溶液均发生疏水缩聚，推断在水溶液条件下，ELP[KV8F-20]在375K时发生相变，400K时ELPs已经变性；在水溶液条件下，ELP[KV8F-20]在350K时发生相变，375K时ELPs已经变性。通过分析，推断疏水作用与结合水的减少在ELP[KV8F-20]的相变过程中起到关键作用。此外，比较不同温度下蛋白的缩聚程度，并结合实验结果，推断出蛋白的相变温度在102℃左右。 本论文完成了一次从ELPs的相变温度预测到基因的从头合成并表达的过程，考察不同种盐对ELP[KV8F-20]相变温度的影响.使用NAMD对ELP[KV8F-20]进行分子动力学模拟，并与实验结果结合，完成了一次ELPs相变机理及盐离子降低相变温度机理的探讨。总结了相关结论，这可为今后利用ELPs纯化重组蛋白提供经验积累和理论依据。 关键词：类弹性蛋白多肽，相变温度，非色谱纯化，分子动力学模拟，相变机理 Abstract Elastin-like polypeptides (Elastin-like polypeptides, ELPs) are elasticity and enviro