封闭负压引流技术对人慢性创面组织中Cski及MMP13mRNA表达的影响.docx

封闭负压引流技术对人慢性创面组织中C-ski及 MMP-13mRNA表达的影响 曾勇简华刚(重庆医科大学附属第二医院急救部400010) 【摘要】目的 研究人慢性创面在经封闭负压引流技术(vacuum-assisted closure, VAC)治疗前后，创缘组织+ C-ski及基质金属蛋口酶MMPJ3表达的改变，从而 探讨VAC促进创面愈合的机制。方法 选取慢性创面病例共14例，在治疗前， 以及治疗后第1、4、7d取创缘的全层皮肤组织，然后采用免疫组织化学检测样 本组织的C-ski及MMP J3的表达变化,并应用RT-PCR检测样本组织屮C-ski mRNA 和MMP-13 mRNA的变化。结果治疗前皮肤组织屮C?ski的表达较少，随着治 疗时间的延长逐渐增加，治疗后第4d起较治疗前显著增加(Plt;0.05)。相反, 治疗前皮肤组织屮MMP-13的表达较多，治疗第Id后开始减少，治疗第4d和 7d后显著减少(Plt;0.05), C-ski mRNA ^1 MMP-13 mRNA的表达趋势同其蛋白 表达变化一样。C?ski阳性表达与MMP-13阳性表达呈显著负相关(r二?0.891) (plt;0.01)o结论VAC治疗后，能够使创缘皮肤组织中的C?ski表达增加,并 且抑制了 MMP?13的表达，进而抑制MMPJ3的蛋白合成，抑制胶原和明胶的降 解，促进慢性创面的愈合。 【关键词】封闭负压引流技术 慢性创面C-ski MMP-13 【中图分类号1R64【文献标识码】A【文章编号］2095-1752 (2012) 15-0048-02 封闭负压引流技术(VAC)对各类创面都有明显的治疗效果。研究表明， 原癌基因在组织修复过程中发挥极其重要的作用。原癌基因C-ski是成纤维细胞 増殖的调节子，它具有促进成纤维细胞增殖的作用。皮肤成纤维细胞是伤口愈合 的重要修复细胞乙一，它的増殖速度与伤口愈合效率密切相关。Wysocki［3］以及 Vaalamo［4］研究发现慢性创面屮金属基质蛋口酶(Metalloproteinases, MMPs)等 表达增加，致使胶原丧失严重，创面难以愈合。通过对慢性创伤的创面的患者进 行VAC处理，然后采用RT-PCR及免疫组化方法检测创缘组织中C-ski及MMP-13 表达的改变，从而探索VAC治疗慢性创面的机制。 1材料与方法 1.1主要试剂 C-ski及MMP-13抗体及免疫组化通用试剂盒购于武汉博士德生物工程 有限公司。RNAiso Plus及RT-PCR试剂盒购于上海生工。 1.2研究对象 选取慢性创面患者为本次试验对象，总共14例（男性9例，女性5例， 年龄18?60岁），包括外伤后创面缺损伴感染6例，紙尾部褥疮3例，小腿静脉 淤滞性溃疡3例，四肢小面积深度烧伤后溃疡形成2例。 1.3方法 1.3.1创面治疗 予碘伏消毒，清除坏死组织，按创面形状剪裁医用海绵，放置于创面, 将塑料引流管带侧孔的一端插入海绵，另一端引出创面，连接到负压吸引装置, 手术贴膜将创面及创周完全封闭，负压调整为-120mmHgo在创面治疗后1、4、 7 d后更换海绵、医用贴膜等。 1.3.2标本收集 分别在治疗前、治疗后第1、4、7d,在创缘取全层皮肤组织块，约 6mmtimes;3mmtimes;2mm大小,并将组织块平均分为2份,1份用于IHC； 1 份用于RT-PCR,冻存时间少于3个月。 1.3.3 RT-PCR 首先提取细胞总RNA, RT-PCR按照试剂盒上说明完成。条件为：94°C 预变性 1.5 min,然后 90°C 1.0 min, 70°C 0.5 min, 75 °C 0.5 min,共 35 个循 环。反应结束后，将5mu;l PCR产物放在1.2%琼脂糖凝胶电泳观察，予Quantity One软件进行扫描半定量分析，以所测得样品光密度积分值与beta;-actin光密 度积分值的比值为样本半定量值。 1.3.4免疫组化测MMP-13及C-ski蛋白表达 分别于每组各吋间点取样本切片3张，分别用于HE染色、MMPJ3及 C?ski的免疫组化染色。细胞质、细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性表达的细胞。 在光镜10times;40视野下，每张切片随机选取5个视野，分别计数视野中的 MMP-13以及C?ski的阳性细胞数，双人讣数，求岀平均值，5个视野计数之和 的平均值为MMP-13及C?ski阳性表达的相对含量。 1.3.5统计学分析 结果以x-plusmn;s表示，用SPSS10.0统计软件进行t检验，并对MMPJ3 和C-ski的阳性表达进行线性相关分析。 2结果 2.1 VAC 治疗后 MMP-13mRNA 和 C-skimRNA 的表达 RT-PCR结果显示：治疗前有较多mRNA表达；治疗Id