第八章 电泳分离技术.ppt

主 要 内 容 第一节 概述 第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 第三节 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 第四节 等电聚焦电泳 第五节 双向凝胶电泳 第六节 毛细管电泳 1.1 电泳的基本概念 电泳：带电物质在电场中向相反电极移动的现象。 电泳迁移率：在单位电位梯度的作用下，单位时间内质点所移动的距离。 电泳分离技术：利用带电物质在电场中泳动速度的差别而进行分离的方法。 1.2 电泳的理论基础 1.2.1 影响电泳速度的因素 ①电场强度： 泳动速度与电场强度成正比； ②溶液的pH值： pH距待分离物质的pI越远，泳动速度越大； ③溶液离子强度： 离子强度越小,电动势越大,泳动速度越快； ④溶液的黏度：泳动速度与溶液的黏度成反比； ⑤电渗现象：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。 ⑥颗粒的性质：一般所带电荷量越大、直径越小或其形状越接近于球形，迁移率就越大。 1.2.2 两种离子型物质A和B的混合物的分离 1.3 电泳技术分类 第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。 聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。 PAGE按凝胶的形状可分为：圆盘状电泳 垂直或平板状电泳 2.1 基本原理 2)光聚合 光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光照形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以加速聚合。 上述聚合反应受许多因素的影响： （1）大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。 （2）低温、低pH都会减慢聚合反应速度。 （3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。 A. 样品的浓缩效应 缓冲液成分及pH的不连续性 浓缩胶pH6.7 缓冲液 浓缩胶Tris-HCl, 电极缓冲液Tris-Gly 缓冲液成分及pH的不连续性导致蛋白质样品浓缩效应示意图 快离子 慢离子 蛋白质样品 凝胶层的不连续性 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 电位梯度的不连续性 E：每厘米的电压降 E＝I(电流强度)/?(电导率) E与电泳速度成正比 电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。 B. 电荷效应 蛋白质样品进入分离胶后， pH增大(pH 8.9)，Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。 由于各种蛋白质pI不同，所载有效电荷不同，因此质点的有效迁移率不同，形成不同区带。 C. 分子筛效应 分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的 泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。 3.2 SDS的操作步骤 试剂与器材 试剂：两性电解质载体pH 3-10 、10%四甲基乙二胺 、10%过硫酸铵 、5%H3PO4 、2%NaOH 、40%蔗糖 、0.04％考马斯亮兰R250 、7%醋酸 器材：圆盘电泳槽 、稳压稳流电泳仪 、脱色摇床 操作方法 1. 凝胶柱的制备 （1）玻璃管的一端插在橡皮帽中(与橡皮接触的部分凝胶不易聚合，可在橡皮帽中先加一滴40%的蔗糖) （2）配胶 表 10mL 7.5%凝胶的配制 试 剂 名 称 体积(mL) 凝胶贮液 2.5 两性电解质载体 0.5 10%TEMED 0.1 蛋白质混合样品 0.1 蒸馏水 6.75 混匀后置真空干燥器中抽气10 min 10%过硫酸铵 0.05 （3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，至离上端1cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。 （4）待凝胶聚合 2. 电泳 小心地拔出玻管，并用蒸馏水洗去蔗糖