超表达苹果细胞分裂素响应基因MdCRF6影响花青苷.pdf

中国农业科学 2017,50(16):3196-3204 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.014 超表达苹果细胞分裂素响应基因 MdCRF6 影响 花青苷积累和盐胁迫抗性 1 2 2 1 1 1 安建平 ，宋来庆 ，赵玲玲 ，由春香 ，王小非 ，郝玉金 1 2 （山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018 ； 烟台市农业科学研究院，山东烟台 265599 ） 摘要：【目的】克隆苹果细胞分裂素响应因子基因MdCRF6 （cytokinin response factor 6），鉴定其在调节 花青苷积累和盐胁迫抗性中的作用，揭示 MdCRF6 的功能，为研究细胞分裂素信号途径和果树生长发育调控提供理 论依据。【方法】以‘嘎啦’苹果（ Malus domestica ‘Gala’）为研究材料，利用同源序列比对和 PCR 技术，分 离细胞分裂素响应基因 MdCRF6。使用 MEGA 5.0 软件构建苹果 MdCRF6 与拟南芥 CRFs 间系统进化树；通过 SMART 软件和 DNAMAN 软件分析 MdCRF6 蛋白的保守结构域。利用实时荧光定量 PCR 方法检测该基因对细胞分裂素和盐胁 迫的响应。通过电泳迁移率试验（EMSA），验证MdCRF6原核表达蛋白对DRE作用元件的绑定。构建MdCRF6 植物超 表达载体，并通过农杆菌介导的遗传转化获得转 MdCRF6 苹果愈伤组织。比较野生型和转基因苹果愈伤组织在花青 苷积累和盐抗性方面的差异，结合基因表达分析，初步鉴定 MdCRF6 在调节花青苷积累和盐胁迫方面的生物学功能。 【结果】分离得到了苹果细胞分裂素响应因子基因 MdCRF6（基因序列号：MDP0000783818），该基因开放阅读框（ORF） 为 1 047 bp，编码含有 348 个氨基酸的蛋白。进化树分析和氨基酸序列比对结果表明，苹果 MdCRF6 蛋白在 N 端 包含保守的 CRF 结构域，在 C 端包含保守的 AP2/ERF 结构域，并且与拟南芥 AtCRF6 同源性最高。基因表达分析 显示该基因具有细胞分裂素和盐胁迫响应，分别在 10 μmol·L-1 -1 BA 和 100 mmol·L NaCl 处理 3 h 和 6 h 时表达 量最高。EMSA 试验结果验证 MdCRF6 原核表达蛋白能够绑定 DRE 序列。在苹果愈伤组织中超表达 MdCRF6，发现 MdCRF6 转基因苹果愈伤组织花青苷积累受到抑制，同时苹果愈伤组织的抗盐性降低。基因表达分析显示，MdCRF6 显著抑制花青苷合成基因和盐响应相关基因的表达。【结论】苹果 MdCRF6 与拟南芥 AtCRF6 具有高度的同源性， 其参与植物对细胞分裂素和盐胁迫的响应。在苹果愈伤组织中超量表达 MdCRF6 抑制其花青苷积累，降低植物抗 盐性。推测苹果 MdCRF6 可能通过结合花青苷合成基因以及抗盐相关基因的启动子，抑制基因的表达，从而负调 节花青苷积累和抗盐性。 关键词：苹果；MdCRF6；花青苷；盐胁迫 Effects of Overexpression of Apple Cytokinin Response Factor Gene MdCRF6 on Anthocyanins Accumulation and Salt Stress T