第四章 凝胶过滤.ppt

Free template from 第四章 凝胶过滤 gel filtration 第一节 凝胶过滤的原理 一、分子筛效应 凝胶过滤是用具有一定孔径的多孔凝胶作为支持物，以水溶液作为流动相，用于分离分子大小不同的生物高分子和有机高分子化合物，以及测定它们的分子量。 与其它原理的层析方法不同，凝胶层析中样品分子并不与基质发生相互作用，所以流动相的组成并不会影响分离度，可以根据后期纯化的需要（继续分离还是保存）而改变流动相的组成。 凝胶层析非常适合于对于pH、金属离子浓度、辅助因子以及环境敏感的生物大分子的分离。 根据实验需要： 流动相中可以保留有某些重要离子或辅助因子、变性剂、尿素、盐酸胍等； 分离可以在高浓度或低浓度离子强度的流动相中进行； 分离可以在37℃或冷室中进行。 第二节 凝胶的分类及性质 第三节 凝胶层析实验技术 十一、硬胶的装填技术 * * 凝胶过滤又叫凝胶层析、分子筛层析、排阻层析。由于凝胶具有网状结构，小分子物质能够进入其内部，而大分子物质却被排阻在外部，当一混合溶液通过凝胶层析柱时，溶液中的物质就按不同分子质量筛分开了。 凝胶过滤有设备简单、操作方便、重复性好和样品回收率高等特点。 常用于分离纯化蛋白质（包括酶类）、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质，还可用于测定蛋白质的分子质量以及样品脱盐。 三维网状空间结构特征 在多数情况下，许多组分均能够不同程度的渗入到凝胶内部，只是进入的含量不同，由于分子大小不同，进入内部孔隙情况不同，分子量大，进入的少，在层析柱中行程短；反之分子量小的，进入的多，在层析柱中行程长，这样它们被洗脱液洗出柱子的时间便产生差异，称为分子筛效应。 二、分配系数Kd 衡量组分被排阻程度的一个特征参数 Kd= 介质内部组分的浓度 介质外部组分的浓度 = C内 C外 A：当分子量大到完全不能进入颗粒内部，即完全被排阻，此时C内=0， Kd=0。 B：当分子量小到完全可以自由进入到凝胶颗粒内部，在分配达到平衡时，凝胶内部与外部组分的浓度相等，此时Kd=1。 C：在一般情况下，凝胶层析中，流动相和固定相溶液的性质是相同的，所以组分在两相中的分配情况主要取决于其分子形状，大小和凝胶颗粒的网孔大小，其0Kd1。 Ve=Vo+KdVi Ve — 组分的洗脱体积，即保留体积 Vo — 外水体积 Vi — 内水体积 Kd — 分配系数 当组分处于被排阻状态时，Kd=0，Ve=Vo； 当组分处于自由进入状态时， Kd=1，Ve=Vo+Vi Vt=Vo+Vi+Vg Vg是凝胶颗粒骨架所占据的体积，相对于Vo+Vi来说，可忽略不计，所以Vt≈ Vo+Vi 对于任何组分来说Vo≤ Ve≤Vt 结论：在凝胶过滤层析中，任何组分其理论洗脱体积最小为Vo，最大不超过一个柱床体积（有特例：产生非特异性吸附， 致使Ve?Vt ，导致检测不到组分活性），所有组分的洗脱峰均出现在Vo和Vt之间。 A：Vt-Vo的值太小，洗脱峰便拥挤在一起，不容易分离 B：通过增加Vt来提高分辨率 C：柱床体积不变，减少上样量 D：减少Vo，减少粒径范围 Vt≈ Vo+Vi Vo→Kd=0，选用兰色葡聚糖2000（分子量200万），呈兰色，在各种型号的凝胶中都被完全排阻。 Vi →Kd=1，选用硫酸铵等与凝胶无吸附力的小分子物质。 凝胶是不溶于水，但在水中有较大膨胀度和较好分子筛功能的一类化合物。 主要有： 葡聚糖凝胶、 天然琼脂糖凝胶和交联琼脂糖、 聚丙烯酰胺凝胶（生物胶）， 交联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚凝胶， 交联琼脂糖与葡聚糖共价结合的凝胶等。 一、葡聚糖凝胶（商品名：Sephadex） 它是由葡聚糖[右旋糖酐(G型)]和3-氯-1,2-环氧氯丙烷（交联剂）以醚键相互交联而形成的。通过控制交联剂浓度大小和葡聚糖与交联剂的比例，以及反应条件可形成不同型号的凝胶。 1、理化性质 外观：白色珠状颗粒，化学性质相对稳定，在酸性溶液中糖苷键易水解，在碱性条件下比较稳定。显微镜下可见表面网状皱纹。带有大量羟基，亲水性好，因此在水溶液中或电解质溶液中极易膨胀。各种型号的葡聚糖凝胶的交联度不同，致使其在水中的膨胀度（床体积），吸水量、筛孔大小和分级范围有明显差异。 GE pharmacia 商品名 Sephadex G-Y 6.5 10 30 流速ml/cm2/h 沸水浴 常温 5hr 3hr 1hr 1000~200000 5K~800K 20 G—200 72hr 10