细胞核的分离和核酸的鉴定.ppt

实验6 细胞核的分离与核酸的鉴定（Separation of cell nuclei and identification of nucleic acids） 遵义医学院生化教研室 * * 1.掌握离心技术的原理及离心机的使用； 2.熟悉提取分离细胞核、细胞质的方法； 3.熟悉鉴定核酸的方法； 一、核酸的种类及其分布 请思考？ DNA、RNA在细胞中的分布： DNA 胞核内(98%) 胞质内(2%) RNA 胞核内(10%) 胞质内(90%) 核酸的种类： DNA、RNA 结论：DNA主要存在于细胞核， RNA主要存在于细胞质。 二、分离细胞质与细胞核 　１.破碎细胞 细胞破碎的方法 机械法 高速组织捣碎机 玻璃匀浆器 研钵 物理法 超声匀浆器 冻融法 化学法 自溶法 酶处理 表面活性剂处理法 利用各细胞器在一定介质中的沉降速度的差异，可采取离心的方法，将细胞器分离出来。 ２.离心技术 细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒 体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。 离 心 方 法 差速沉降离心法 速率区带离心法 等密度区带离心法 密度梯度区带离心法 √ √ 差速沉降离心法 (differential centrifugation) 采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。 加速 低速 高速 差速沉降离心法一般用于分离沉降速度相 差较大（一般为10倍）的颗粒。? 　缺点：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒； 　 ②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高 时，在离心管一侧会出现沉淀； ③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗 粒变形、聚集而失活。　 　 每种纯样品成份在介质溶液中的沉降速度可以表为： V=d2÷18×(σ-s)÷η×ω2r。 V： 是某一时刻样品的沉降速度（厘米/秒）； d： 样品颗粒的直径（厘米）； σ：样品颗粒的密度（克/厘米3）； s： 介质溶液的密度（克/厘米3）； η：介质溶液的粘性系数（克/厘米·秒）； ω：离心机重轴的旋转角速度（1/秒），ω=2πN÷60，N：转/分； r：颗粒所在位置与旋转轴心之间的距离，即离心半径（厘米）； 密度梯度离心法的理论依据 待分样品的沉浮行为如何确定？ 当σS时 V0即样品顺离心力方向沉降σS时 V0即样品逆离心力方向上浮σ=S时 V=0即样品停止沉降或上浮，“稳定”在这一位置用这个公式可以很好地解释在速率区带离心法或等密度区带离心法中单一样品的沉降（或上浮）行为。 速率区带离心法 人为地加入不同密度的活性物质，形成一个较为平缓的介质梯度，将样品加在介质中进行离心，在一定的离心力下根据颗粒的沉降速度不同最后分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。 此法用于分离具有一定沉降速度差的颗粒（沉降速度差为20% 或更少）或分子量相差3倍的蛋白质。适用于分离密度相似而大小有别的样品。 样品在密度较高、密度梯度较为陡峭的介质溶液中进行离心，具有不同密度的颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度区带离心法。 等密度区带离心法 此方法适用于分离大小相近而密度不同的样品。 优点：a. 分离效果好，可一次获得较纯颗粒。 b. 适应范围广,能象差速离心法一样分离具有沉降 系数差的颗粒,又能分离有一定浮力密度差的颗粒。 c. 颗粒不会挤压变形。 缺点：a.离心时间较长； b.需要制备梯度；操作严格，不易掌握。 密度梯度区带离心法 (density gradient centrifugation) 三、核酸的鉴定 核 酸 核苷酸 磷 酸 碱 基 戊 糖 定糖法（戊糖的差异） （1）核糖核酸的鉴定 浓HCl ＋ 3H2O + β－ D－核糖 糠醛 　 糠醛 　 3，5－二羟基甲苯　 绿色化合物 RNA　　　　　　　　　　　　 ＯＨˉ　　　　　　　　　　　　 水解　　　　　　　　　　　　 β－ D－核糖 地衣酚法: （2）脱氧核糖核酸的鉴定 DNA Ｈ＋　　　　　　　　　　　　 水解　　　　　　　　　　　　 β－D－２－脱氧