第六章发酵途径总结.ppt

第六章 酵母好氧条件下Py进入TCA循环不入乙醇途径，因为氧化磷酸化与底物水平磷酸化竞争ADP并生成更多的ATP，若保持充足供氧，则继续高速生长，实现高密度发酵。 厌氧条件下，Py不进入TCA而去乙醇合成途径。因无氧，只能通过EMP途径功能，导致ATP生成量低，若保持细胞生长，只能通过EMP通量增大来满足。 巴斯德效应：发酵状态酵母在通氧时糖耗下降、乙醇生产量降低；停止通气糖耗和乙醇产率大幅提高的现象。 原因：供氧，ETC氧化NADH，能量得率高（36/38 mol ATP/mol Glucose，而EMP途径仅2 mol ATP；氧充足条件是厌氧条件产能效率的18倍），细胞生长迅速，但是不用消耗那么多的Glucose即可满足细胞生长代谢的需求，而且不用生成乙醇来氧化NADH，使乙醇生成效率下降甚至停止；反之，厌氧条件下，EMP途径产能效率仅为好氧条件的1/18，即单位时间必须消耗18 mol的Glucose才能达到好氧条件的产能/供能效率，所以糖耗速率是好养条件下的18 倍，而且必须通过生成乙醇来氧化NADH，使得乙醇合成效率大幅度提高。 酵母代谢调控过程的研究进展 很多学者已经研究了酿酒酵母对不同氮源的吸收利用的途径与机理，以及不同氮源相互之间的作用。 酵母可以利用不同的氮源，但并不是每种氮源都可以很好地支持酵母的生长。氨、谷氨酞胺和天冬酞胺等为比较好的氮源，而在脯氨酸和尿素等中生长速率比较慢。 酵母对一种氮源的利用首先要将其转化为谷氨酸或谷氨酞胺，以它们作为氮的供体合成其它的含氮化合物。 在谷氨酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶的作用下谷氨酸或谷氨酰胺可以由氨作为氮的供体而直接合成。当谷氨酸作为氮源时，谷氨酞胺合成酶利用谷氨酸和从谷氨酸到a-酮戊二酸反应中生成的氨合成谷氨酞胺。 氨、谷氨酸和谷氨酞胺之间的相互转化被称为氮的中间代谢途径C(netarl Nirtogen Metbolism，CNR)  酿酒酵母发酵条件下关键代谢酶活性分析 环境的变化会在细胞内产生响应，包括基因水平、蛋白质水平、酶活性水平，代谢系统自我调控以适应环境变化。相对于研究细胞内个别化学反应的变化，对代谢体系本身所产生的系统而精细的调控的研究更重要。 在不同的环境下，胞内的酶系会作出系统的调整与响应。胞内酶活性受到可逆结合的因子、共价修饰和酶浓度等因素的影响。 在第一种情况下，酶上特定的位点被信号分子结合而抑制或者激活，产生构象的变化，该信号分子可能是该酶或其他酶所催化反应的底物或者产物，比如变构效应等。 在共价修饰的情况下，酶的结构可以被其他酶所催化的反应来改变，比如磷酸化。mRNA转录的速率受到严格的控制，酶的活性很大程度直接反应在酶的浓度上。 样品制备 样品在10000 rpm，4度下离心10分钟，收集细胞。用100 mM Tris一Hcl(pH7.0) 溶液洗涤2次，溶液包含20 mM的KCI，5 mM的MnSO4和0.1mMEDAT，然后重新悬浮在同样的溶液中(每15 g湿细胞悬浮在50ml缓冲液中)。悬浮液置于冰槽中，在超声波破碎仪中超声波破碎1min。细胞碎片在10000 rpm，4℃下离心分离，得到的粗细胞抽提液用来迅速测量酶活性或者保存在-20℃。 酶活性检测在可控温度的分光光度计上进行。反应所需混合物加入到1cm光程的石英比色皿中，最后加入细胞抽提液或者底物达到总体积为1ml，并且启动反应。在波长340 nm下测量NADH，NADPH的变化。每单位酶活性定义为每分钟每毫克蛋白质转化1umol底物所需的酶。 NADPH是辅酶，为什么我的反应体系中没有加酶，只是加底物和NADPH，其OD值也在下降，这是为什么呢？我的反应体系体积200uL,NADPH的终溶度是0.5mM NADPH在自然状态下容易被氧化分解，加入2-巯基乙醇是还原剂，可以减少氧化 加PMSF是因为PMSF（苯甲基磺酰氟 ）是一种蛋白酶抑制剂，可以有效的抑制菌体裂解后的释放出的丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶的活性。防止它们降解消化目标蛋白。需注意PMSF溶解于水溶液后自身会迅速降解，大约1小时会自身降解完毕即失去作用。需要每1小时补加一些新鲜的PMSF。加DTT是因为DTT（二硫苏糖醇）是一种还原剂。 发酵条件 PYK趋势相反，乙酸为碳源酶活性远远低于前两者，因其不在EMP系统中。 酿酒酵母在发酵不同阶段和以乳酸为碳源下的蛋白质组解析和酶活性分析 第一个样品取在葡萄糖作碳源的对数生长期，此时葡萄糖正在迅速地被消耗，同时主要积累了乙醇等代谢产物。在发酵的后期，葡萄糖被消耗光，菌体调整了体内的酶系，转而利用乙醇产生了二次生长的现象。在第10个小时取得的样品就代表了酵母开始利用发酵前期积累的乙醇为碳源的情况。 说明乙醇为碳源的基本培养基中利用酿酒酵母表达外源基因时所表现