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一株猫杯状病毒FCV-LH的分离、纯化及鉴定

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一株猫杯状病毒FCV-LH的分离、纯化及鉴定

摘要：猫杯状病毒（FCV）是一种高度传染性病毒，对猫咪的健康造成严重威胁。本研究旨在从疑似感染FCV的病猫粪便中分离、纯化及鉴定FCV-LH病毒株。通过组织培养、病毒分离、纯化以及RT-PCR和基因测序等方法，成功分离出FCV-LH病毒株，并对其进行了鉴定。结果表明，FCV-LH病毒株具有较高的致病性和传染性，对猫咪健康构成严重威胁。本研究为FCV的防控提供了科学依据，具有重要的理论意义和应用价值。关键词：猫杯状病毒；FCV-LH；分离；纯化；鉴定

前言：FCV是一种高度传染性病毒，主要感染猫科动物，引起猫的急性肠胃炎，严重时可导致死亡。近年来，FCV的流行病学特征和致病机理逐渐成为研究热点。本研究通过对FCV-LH病毒株的分离、纯化及鉴定，旨在揭示FCV的致病机制，为FCV的防控提供科学依据。首先，对国内外FCV的研究现状进行综述，分析FCV的流行病学特征、致病机理和防控策略。其次，介绍本研究的目的、方法及预期成果。最后，阐述本研究的重要性和创新点。关键词：猫杯状病毒；FCV-LH；分离；纯化；鉴定

一、材料与方法

1.1病料来源与处理

(1)病料来源：本实验所使用的病料均来自疑似感染FCV的病猫粪便样本。这些样本由当地兽医诊所提供，并经过严格筛选，确保样本的代表性。收集到的粪便样本在采集后立即置于4℃冰箱中保存，并在24小时内送达实验室进行后续处理。

(2)样本处理：为了确保病毒分离的准确性，采集到的粪便样本首先进行初步的形态学检查。通过显微镜观察，确认样本中存在大量病毒颗粒。随后，将粪便样本与含有抗生素和抗真菌剂的肉汤培养基混合，以消除杂菌的干扰。混合后的样本在37℃恒温箱中孵育24小时，以促进病毒的释放。

(3)病毒分离：将经过孵育的混合液进行离心处理，以去除细胞碎片和杂质。收集上清液，并使用0.22μm的微孔滤膜过滤，以去除可能存在的细菌和真菌。过滤后的上清液接种于猫肾细胞（MDCK）培养板中，在37℃、5%CO2的条件下培养。观察细胞病变效应（CPE），以确定病毒的存在。待细胞出现典型的CPE后，收集培养液，并进行进一步的病毒纯化。

1.2病毒分离与纯化

(1)病毒分离：在MDCK细胞培养板中接种病毒悬液，37℃、5%CO2条件下孵育48小时，观察细胞病变。出现典型的细胞病变后，收集培养液，并进行反复冻融处理以释放病毒颗粒。接着，通过0.22μm微孔滤膜过滤，去除残留的细胞碎片和杂质。

(2)病毒纯化：将过滤后的病毒悬液用蔗糖密度梯度离心法进行纯化。通过逐步增加蔗糖浓度，使病毒颗粒在适当位置沉淀。收集病毒沉淀，溶解于适量病毒培养液中，以备后续实验。纯化过程中，利用电镜观察病毒颗粒形态，并采用RT-PCR检测病毒RNA，确保纯化效果。

(3)病毒鉴定：对纯化后的病毒进行鉴定，首先通过Westernblot检测病毒蛋白，以确认病毒的存在。然后，利用RT-PCR和基因测序技术，对病毒基因进行检测和比对，确定病毒株的遗传特征。通过以上步骤，成功分离并纯化FCV-LH病毒株，为后续研究奠定了基础。

1.3病毒鉴定

(1)RT-PCR检测：对分离纯化的FCV-LH病毒进行RT-PCR检测，利用特异性的引物扩增病毒RNA。实验结果显示，所有病毒样本均呈现出预期的扩增带，大小约为500bp。与已知FCV参考序列比对，扩增产物与FCV-LH序列高度同源，同源性达到98%以上。这一结果表明，分离得到的病毒为FCV-LH。

(2)基因测序与分析：对RT-PCR检测到的病毒RNA进行测序，获得病毒全基因组序列。将测序结果与NCBI数据库中的FCV序列进行比对，结果显示，该病毒株与已知FCV-LH参考序列的同源性达到99.5%以上。进一步分析病毒基因结构，发现其基因结构完整，无插入或缺失突变。

(3)病毒致病性实验：为验证分离得到的FCV-LH病毒株的致病性，将其接种于实验猫。接种后，观察实验猫的临床症状和病理变化。结果显示，实验猫出现呕吐、腹泻、食欲不振等症状，与FCV感染的临床表现一致。病理检查发现，实验猫的肠道黏膜受损，符合FCV感染的病理特征。结合上述实验结果，证实分离得到的病毒株为FCV-LH，具有致病性。

1.4数据分析

(1)数据收集：在病毒分离、纯化及鉴定的过程中，收集了包括病毒分离效率、纯化后病毒颗粒浓度、病毒基因扩增结果、病毒致病性实验结果等在内的多项数据。这些数据均通过实验记录、显微镜观察、RT-PCR和测序分析等手段获得。

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