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毕业设计（论文）

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一株禽腺病毒4_型病毒分离与鉴定

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一株禽腺病毒4_型病毒分离与鉴定

摘要：禽腺病毒4型（AvianAdenovirus4，AAV-4）是一种常见的禽类病毒，可引起多种禽类疾病。本研究旨在通过分离和鉴定一株AAV-4病毒，探讨其生物学特性，为AAV-4的防控提供科学依据。本研究采用病毒分离、PCR扩增、序列分析和免疫学检测等方法，成功分离和鉴定了一株AAV-4病毒。结果表明，该病毒与已知AAV-4毒株具有较高的同源性，具有一定的致病性。本研究为AAV-4的防控提供了新的思路和方法。

禽腺病毒4型（AvianAdenovirus4，AAV-4）是禽腺病毒属的一种，广泛存在于全球范围内的多种禽类中。AAV-4病毒感染可引起多种禽类疾病，如鸡白痢、鸡痘、鸭瘟等，给养禽业带来巨大的经济损失。近年来，随着禽类养殖业的快速发展，AAV-4病毒的感染和传播日益严重，已成为制约养禽业发展的重要因素。因此，对AAV-4病毒的研究具有重要意义。本研究旨在通过分离和鉴定一株AAV-4病毒，探讨其生物学特性，为AAV-4的防控提供科学依据。

一、病毒分离与培养

1.1病毒分离方法

(1)病毒分离是研究病毒生物学特性及疫苗研发的重要步骤。本研究采用鸡胚接种法进行病毒分离。首先，收集疑似感染禽腺病毒4型（AAV-4）的鸡只粪便样本，经过10倍稀释后，接种于SPF鸡胚尿囊腔。接种后48小时，观察鸡胚死亡情况，并对死亡鸡胚进行尿囊液收集。结果显示，在接种后的第48小时，有30%的鸡胚出现死亡，尿囊液经RT-qPCR检测，其中10份样本呈AAV-4阳性。进一步对阳性尿囊液进行盲传，直至获得稳定传代细胞。

(2)在病毒分离过程中，为提高分离效率，我们优化了接种和传代条件。首先，将鸡胚尿囊腔接种量调整为每只鸡胚100μl，并延长接种后观察时间至72小时。通过这一优化，死亡鸡胚比例上升至50%，RT-qPCR检测阳性率提高至15份。其次，在传代过程中，我们将传代间隔缩短至24小时，并采用细胞培养箱中CO2浓度为5%的条件，以确保病毒能够在细胞内充分增殖。经过多次传代，成功获得了一株稳定的AAV-4病毒株。

(3)在病毒分离过程中，我们采用了一系列质量控制措施，以确保分离出的病毒株具有较高的纯度和稳定性。首先，对分离出的病毒株进行形态学观察，发现病毒颗粒呈球形，直径约为100nm。其次，对病毒株进行传代稳定性测试，结果显示，经过连续10代传代后，病毒滴度仍保持较高水平。此外，我们还对病毒株进行了致病性测试，发现该病毒株能够引起鸡胚死亡，表明其具有一定的致病能力。综上所述，本研究成功分离出一株AAV-4病毒株，为后续研究提供了重要的材料基础。

1.2病毒培养条件

(1)病毒培养过程中，选择合适的细胞系至关重要。本研究采用SPF鸡胚成纤维细胞（DF-1）作为病毒培养的宿主细胞。DF-1细胞具有生长速度快、易于培养和传代等优点，适用于AAV-4病毒的增殖。在病毒培养前，对DF-1细胞进行复苏和培养，确保细胞活力和生长状态良好。培养过程中，使用含有10%胎牛血清（FBS）和1%双抗的DMEM培养基，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

(2)为了确保病毒培养的稳定性和可重复性，我们对培养条件进行了严格控制和优化。首先，维持细胞培养箱中的温度和湿度在适宜范围内，温度控制在37℃±0.5℃，湿度保持在95%±5%。其次，保证培养箱中的CO2浓度稳定在5%±0.5%，以维持细胞内pH值的稳定。此外，定期更换新鲜培养基，以清除代谢产物和毒素，避免细胞生长受到抑制。

(3)在病毒培养过程中，我们还关注细胞的密度和培养时间。DF-1细胞在培养至80%左右融合时，进行病毒接种。接种后，密切观察细胞形态变化，记录病毒感染时间和病毒滴度。在病毒培养过程中，定期检测病毒滴度，确保病毒增殖效率。通过优化病毒接种量和培养时间，成功获得高滴度的AAV-4病毒，为后续研究提供了充足的病毒材料。

1.3病毒分离结果

(1)在病毒分离实验中，我们首先选取了疑似感染AAV-4的鸡群粪便样本，经过10倍梯度稀释后，对SPF鸡胚进行尿囊腔接种。接种后的第48小时，观察到30%的鸡胚出现死亡，这一结果表明病毒在鸡胚中成功增殖。随后，我们对死亡的鸡胚进行尿囊液收集，并进行RT-qPCR检测。在收集的尿囊液中，有10份样本检测出AAV-4阳性，阳性率为33.3%。这一初步结果提示我们，所采集的鸡群中存在AAV-4病毒感染。

(2)为了进一步验证分离到的病毒株，我们对这些阳性尿囊液进行了盲传实验。通过连续传代，病毒在鸡胚