《《实验四 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白》》.ppt

实验四 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 目的1、掌握电泳的基本原理 2、掌握电泳的基本操作 原理电泳:带电颗粒在电场中泳动的现象 　　各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量等不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。 不用支持物的 利用支持物 1）纸电泳 2) 淀粉凝胶电泳 3) 琼脂糖凝胶电泳 4）醋酸纤维薄膜电泳 5）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 泳动度U 泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度 U=v/E=dl/Vt E:电场强度，每cm的电压降，V/l v:颗粒的移动速度，d/t d:颗粒的移动距离 t:通电时间 V:加在支持物两端的实际电压 l:支持物的有效长度 影响泳动速度的主要因素 1）电场强度：（越大，移动速度越快） 常压电泳：100-500V，2-10V/cm 高压电泳：500-10000V， 20-200V/cm 2）溶液的pH值：buffer。8.60 3）溶液的离子强度： （I越大，速度越慢；缓冲 效果越好） ，0.02-0.2之间。0.07 4）电渗现象：液体在电场中相对于固体支持物的相对移动。 尽量避免有高电渗作用的支持物。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） Davis 和Ornstein 1959年人血清蛋白 聚丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺（Acr，单体）和N,N′-甲叉双丙烯酰胺（Bis，交联剂）共聚合而成（由过硫酸铵-四乙基乙二胺TEMED系统或核黄素-TEMED系统激发）。 分子筛，可通过调节单体浓度或与交联剂的比例来控制孔径大小，达到不同的分离目的。 凝胶可以是平板（垂直板型）或柱子（盘状） 作 用 使蛋白质成为亚基物质，形成蛋白质-SDS胶束，消除蛋白质分子之间的电荷、形状差异；椭圆棒状，短轴均为1.8nm，长轴正比于蛋白质分子量。 MW在15?200kDa，电泳迁移率与分子量对数呈线性关系。 logM=a-bRf，Rf为迁移率 醋酸纤维薄膜电泳(CAME) 以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物的一种区带电泳技术，将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8.6的缓冲液中电泳，血清蛋白质均带负电荷移向正极。 由于血清中各蛋白组分等电点不同而使表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。 电泳后，CAM经染色和漂洗，可清晰呈现清蛋白、α1、α2、β、γ—球蛋白5条区带。 人血清中常见蛋白质的等电点和分子量 蛋白质 等电点 分子量 正常参考值（%） 清蛋白 4.88 69000 57-68 α1-球蛋白 5.06 200000 1.0-5.7 α2-球蛋白 5.06 300000 4.9-11.2 β -球蛋白 5.12 90000-150000 7-13 γ-球蛋白 6.85-7.2 156000-300000 9.8-18.2 负极 正极 器 材 1．醋酸纤维薄膜(8X2mm) 2．点样器 3．染色皿，漂洗器，镊子  4．电泳仪：电泳仪电源，水平电泳槽 试剂 1．巴比妥缓冲液(pH8.6 )：取巴比妥钠12.76g，巴比妥1.66g，加蒸馏水加热溶解后稀释至1升。 2．氨基黑10B染色液：取氨基黑10B 0.5g，甲醇50ml，冰醋酸l0ml，加水至100ml。 3．漂洗液：95％乙醇45ml、冰醋酸5ml、蒸馏水50ml 操作-准备 l．醋酸纤维薄膜(CAM)的准备：薄膜放进缓冲液中，自然浸润，约20分钟。 2．电泳槽的准备：水平放置，将缓冲液注入电泳槽中，两边缓冲液高度一致，架上滤纸桥，盖上电泳槽盖. 3．点样：将充分浸透(指膜上无白色斑痕)的薄膜取出，用滤纸轻轻吸去膜上过多缓冲液，粗糙面(无光泽面)用于点样，载玻片蘸取血清，垂直印在CAM粗糙面上。 操作电泳 4．加样后，将薄膜条架于支架两端，点样面朝下，点样侧置于负极端。薄膜应平直无弯