RTPCR原理与实验操作步骤讲解行业资料实验.docx

先将1-10μl左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸g110.00Trizol100ml/1 先将1-10μl左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸 g110.00Trizol100ml/1瓶Invitroge 高压（不需要泡DEPC）三、试剂配制：DEPC水：吸出1ml 放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml RT-PCR原理与实验操作步骤 关键词： RT-PCR 逆转录酶 reversetranscriptase 聚合酶 链式反应 引物设计 DNA 聚合酶 一、知识背景： 1、基因表达： DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104 个丝心蛋白 mRNA （每个 mRNA 存活 4d，可以合成 105 个丝心蛋白） 共合成 109 个丝心蛋白。因此单拷贝基因的 mRNA 表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 2、PCR 技术(olymerase chain reaction) ：即聚合酶链式反 应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决 定。反应分三步： A、变性：通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂，形成单链 DNA； B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结 合。 . . BE稀释10倍成0.5TBE BE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度 一、实验器具与材料：移液枪：1ml、200μ20μ10μ2μ 中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。2）引物设计原则的把 C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs与Mg2＋存在下，退火引 C 、延伸：在 DNA 聚合酶和 dNTPs 与 Mg2 ＋存在下，退火 引物沿 5 3方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。 3、逆转录酶和 RT-PCR 逆转录酶（ reverse transcriptase ）是存在于 RNA 病毒体内 的依赖 RNA 的 DNA 聚合酶，至少具有以下三种活性： 1、依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活性：以 RNA 为模板合成 cDNA 第一条链； 2、Rnase 水解活性：水解 RNANA 杂合体中的 RNA； 3、依赖 DNA 的 DNA 聚合酶活性： 以第一条 DNA 链为模板 合成互补的双链 cDNA. 二、 RT-PCR的准备： 1、引物的设计与其原则： 1 ）引物的特异性决定 PCR 反应特异性。因此引物设计是否 合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充 分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同 的 mRNA 剪切方式以与可能存在的 hnRNA 对引物的特异性 . . ′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′pC ′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′p C过夜，再烤干）...匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再 板合成cDNA第一条链；Rnase水解活性：水解RNANA杂 515.377.231七、引物合成科威）正义：5′-CACG 的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的 蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 2 ）引物设计原则的把握：引物设计原则包括 a 、引物长度:一般为 15 ～ 30bp ，引物太短会影响 PCR 的 特异性，引物太长 PCR 的最适延伸温度会超过 Taq 酶的最 适温度，也影响反应的特异性。 b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶 的聚集存在，特别是连续出现 3 个以上的单一碱基。 GC 含 量（ Tm 值）： 40％～ 60％， PCR 扩增的复性温度一般是较 低 Tm 值减去 5 ～ 10 度。 c、 3端要求： 3端必须与模板严格互补，不能进行任何修 饰，也不能有形成任何二级结构的可能。 末位碱基是 A 时错 配的引发效率最低， G 、C 居中间，因此引物的 3端最好选 用 A、G 、C 而尽可能避免连续出现两个以上的 T。 d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则 会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。 e 、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于 4 个连续 碱基互补， 3端不应超过 2 个。 . . /μl0.3μl(1μ /μl0.3μl(1μl)10pmol...下游引物10pm 5%乙醇（用DEPC水配）1ml...↓4℃离心7500g， 链为模板合成互补的双链cDNA.二、RT-PCR的准备：引物 混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30- f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续 8 个的互补碱基存在。 g