牛奶中阿维菌素类药物残留检测——高效液相色谱法(SOP)修改版_新.doc

PAGE \* MERGEFORMAT7 牛奶中阿维菌素类药物残留检测—高效液相色谱法 安全要求 该检验的提取、净化步骤应在通风橱中进行，操作中需着工作服、戴口罩手套，避免溶剂气体吸入和皮肤接触；废弃的化学试剂收集到专用容器集中处理。 急救措施 皮肤触到有机溶剂或酸,用清水清洗，溅入眼中用纯水灌洗。 3 适用范围 该操作规程适用于牛奶中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素残留量的制样及测定。 4 职责 进行该项检验的检验员必须按该操作规程进行检验，质量监督员负责监督该操作规程的正确执行。 5 检测原理 用乙腈提取试料中残留的阿维菌素类药物，加水稀释，加三乙胺使溶液呈弱碱性，C18固相萃取柱净化，加三氟乙酸酐和N-甲基咪唑衍生化。高效液相色谱-荧光检测法测定，外标法定量。 6 方法灵敏度 本方法在牛奶中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的检测限均为1μg/kg，定量限均为2μg/kg。 7 注意事项 7.1 整个净化步骤控制C18柱流速约在1～2 mL/min； 7.2 C18柱使用过程中除特别说明外，应避免柱床干涸。 8 材料、仪器、试剂的准备及基本要求 除特别注明外，以下所用试剂均为分析纯；水为超纯水。 8.1 阿维菌素标准品 含量≥95.7% 8.2 多拉菌素标准品 含量≥92.6% 8.3 伊维菌素标准品 含量≥93.9% 8.4 乙腈 色谱纯 8.5 甲醇 色谱纯 8.6 三氟乙酸酐 8.7 三乙胺 8.8 异辛烷 8.9 N-甲基咪唑 8.10 C18固相萃取柱 500 mg/6 cc，或相当者 8.11 固相萃取柱洗涤液；取乙腈30 mL、水70 mL和三乙胺20 μL，混匀。 8.12 衍生化试剂 a) A液：N-甲基咪唑-乙腈（1+1，v/v）。现用现配。 b) B液：三氟乙酸酐-乙腈（1+2，v/v）。现用现配。 8.13 1 mg/mL 阿维菌素类药物混合标准贮备液： 分别称取阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素标准品10 mg，精密称定，于10 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度。配制成阿维菌素类药物浓度为1 mg/mL的混合标准贮备液， -20℃保存，有效期6个月。 8.14 10 μg/mL 阿维菌素类药物混合标准工作液： 准确量取混合标准贮备液0.25 mL，于25 mL量瓶中,用乙腈稀释并配制成阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素浓度为10 μg/mL标准工作液。-20 ℃保存，有效期1个月。 8.15 1 μg/mL 阿维菌素类药物混合标准工作液： 准确量取10 μg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液2.5 mL，于25 mL量瓶中,用乙腈稀释配制成阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素浓度为1 μg/mL标准工作液。-20 ℃保存，有效期1个月。 8.16 高效液相色谱仪（配荧光检测器） 8.17 分析天平 感量0.00001 g 8.18 天平 感量0.01 g 8.19 振荡器 8.20 离心机 8.21 涡旋混合仪 8.22 聚丙烯离心管 50 mL 8.23 氮吹仪 8.24 C18固相萃取柱 500 mg/6 cc，或相当者 8.25 微孔滤膜 0.45 μm 9 检验步骤 9.1 试料的制备 9.1.1 取混匀后的供试样品，作为供试试料。 9.1.2 取混匀后的空白样品，作为空白试料（阴性对照）。 9.1.3 取混匀后的空白样品5 g,添加1 μg/mL的工作液0.05 mL，作为空白添加试料。 9.2 标准曲线的制备 精密量取1 μg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液0.02、0.05、0.1 mL，于10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度；精密量取10 μg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液0.25 mL，于50 mL量瓶中，0.1、0.3 mL至10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，配制成浓度分别为2、5、10、50、100、300 ng/mL的阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素混合标准溶液，各取1.0 mL于各自的10 mL试管中，于50 ℃水浴氮气吹干，按衍生化步骤处理后，将系列标准溶液，供高效液相色???测定，从低浓度到高浓度依次测定，每一浓度进样3针。以测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。 9.3 提取 9.2.1 称取(5±0.05) g试料，于50 mL离心管中，加乙腈8 mL，涡旋混匀，中速振荡5 min，5000 r/min离心10 min。 9.2.2 收集上清液于另一50 mL离心管中。残渣再重复提取一次。 9.2.3 合并两次上清液，加水15 mL和三乙胺50 μl，混匀，备用。 9.4 净化 9.4.1 依次用乙腈5 mL、固相