生物化学课件-11.核酸结构与功能II.ppt

十一章、核酸的理化性质及分析方法

一、核酸的水解特性1.酸水解水解糖苷键和磷脂键。水解中，糖苷键比磷脂键更易于被水解，嘌呤比嘧啶更易于水解。2.碱水解RNA碱水解产物为核苷酸，水解过程中生成2,3-环磷酸酯中间产物。DNA对碱有较强的耐性。

3.酶水解水解核酸的酶根据其专一性分核糖核酸酶和脱氧核糖核酸；根据对底物的作用方式分内切酶和外切酶；根据产物有3‘—磷酸核苷酸和5’—磷酸核苷酸，

限制性内切酶限制性内切酶主要是切断双链DNA,并有特殊的识别位点，其位点的具有旋转对称。酶切以后，多数产生一个粘性末端。

RestrictionenzymesRestrictionenzyme-anenzymewhichcutsspecificDNAsequences,endonuclease “bluntend”vs.“stickyend”Cleavageisrestrictedtospecific,4-6bpsequences(foreignbacteria);alwayspalindromicsequenceMorethan800arenowknown

RestrictionEndonucleasesEcoRI:E.coli strainR 1stenzymefoundGAATTCG GAATTCCTTAAGCCTTAAGHpaI GTTAAC GTTAAC CAATTG CAATTG

Arestrictionenzyme(EcoRI)1.6-basecutter4.producesa5’overhang2.Specificpalindromicsequence(5’GAATTC)3.Cutswithintherecognitionsequence(typeIIenzyme)

Restrictionenzymes!

二、酸碱性质

（一）解离基团：主要是碱基，磷酸。核糖的解离常数很高，在12以上，一般不考虑。

（二）核酸的等电点腺苷酸，鸟苷酸和胞苷酸的pI值由下式决定：pI=(pKa1+pKa2)/2其中pKa1为第一磷酸基团的解离常数，pKa2为含氮环上—NH=的解离常数。尿苷酸环上的没有—NH=的碱性很弱，所以没有两性离子形成。一般RNA的等电点为2.0-2.5；DNA的等电点在4-4.5.

三、核酸的紫外吸收

核酸的紫外吸收峰为260nm，蛋白质的紫外吸收峰为280nm。通常用A260/A280值测定核酸的纯度，DNA的比值要大于1.8，RNA的比值要大于2.0.双链DNA，单链DNA和寡核苷酸的紫外吸收强度不同，寡核苷酸最强，单链DNA或RNA次之，双链DNA最弱。

用紫外吸收测定核酸含量：DNA：1A260=50ug/mlRNA（或单链DNA):1A260=40ug/ml寡核苷酸：1A260=20ug/ml

四、核酸的变性和复性

DNA变性是指DNA的双链解开成单链的现象。这个过程叫变性过程。变性不仅指DNA，RNA也同样有变性现象。因为RNA也有部分分子内的双链。变性后，DNA的A260增强，这一效应叫增色效应。（一）DNA变性(denaturation)

引起核酸变性的因素有：热变性，酸碱变性，变性剂（如尿素）。DNA的熔点：DNA热变性时，DNA会在某一很窄的温度范围内DNA突然变性（解链），类似于晶体熔解，所以将DNA变性一半时的温度定义为DNA的熔解温度或DNA的熔点，用Tm表示。

影响Tm值大小的因素1.DNA的均一性：均质DNA熔解温度在一个很窄的范围内，异质DNA的熔解温度范围变宽。2.G-C含量：G-C含量与Tm之间存在以下关系：(G+C)%=(Tm-69.3)X2.443.介质中的离子强度:离子强度越高，Tm值越大。

（二）复性（renaturation)变性DNA在适当的条件下，重新恢复成双链（双螺旋）结构，这一过程叫复性。DNA复性后，A260的值有减色效应。

复性速度用Cot1/2表示，其中Co表示DNA的初始浓度。t1/2表示DNA复性一半时的时间。Cot1/2的大小与DNA的长度和重复程度有关。

（三）核酸的分子杂交